Summary

Vurdering af DNA-dobbeltstrengsbrudsreparationsaktivitet ved hjælp af højkapacitets- og kvantitative luminescensbaserede reporteranalyser

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Vi præsenterer protokoller til vurdering af dobbeltstrengsbrudsreparationsvejens færdigheder i celler ved hjælp af en række luminescensbaserede ekstrakromosomale reportersubstrater.

Abstract

Reparation af DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB’er) er afgørende for opretholdelsen af genomstabilitet og cellelevedygtighed. DSB-reparation (DSBR) i celler medieres gennem flere mekanismer: homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ) og enkeltstrenget udglødning (SSA). Cellulære assays er afgørende for at måle færdighederne og moduleringen af disse veje som reaktion på forskellige stimuli.

Her præsenterer vi en række ekstrakromosomale reporteranalyser, der hver måler rekonstitutionen af et nanoluciferase-reportergen ved en af de fire store DSBR-veje i celler. Ved forbigående transfektion til celler af interesse kan reparation af vejspecifikke reportersubstrater måles på under 24 timer ved påvisning af Nanoluciferase (NanoLuc) luminescens.

Disse robuste assays er kvantitative, følsomme, titrerbare og modtagelige for et screeningsformat med høj kapacitet. Disse egenskaber giver brede anvendelser inden for DNA-reparationsforskning og lægemiddelopdagelse, der supplerer den aktuelt tilgængelige værktøjskasse af cellulære DSBR-analyser.

Introduction

DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB’er) repræsenterer en særlig giftig klasse af DNA-skader1, på grund af hvilken celler har udviklet flere DSB-reparationsveje (DSBR) til at reparere disse læsioner. De fire vigtigste DSBR-mekanismer er homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ) og enkeltstrengsudglødning (SSA)2,3. DSBR-veje bidrager til opretholdelsen af sund vævsudvikling og fysiologi og beskytter mod sygdomme som kræft. Desuden rummer disse reparationsmekanismer terapeutisk potentiale for udvikling af små molekylemodulatorer inden for præcisionsonkologi. For eksempel har målretning mod DNA-polymerase θ (Polθ), et centralt enzym i MMEJ-reparationsvejen, tiltrukket sig interesse på grund af dets syntetiske dødelighed med HR-mangel i kræft4.

Forståelse af DSBR har derfor brede kliniske implikationer, og funktionelle cellulære assays, der er i stand til at måle aktiviteten af alle de store DSBR-veje, er nødvendige5. Assays skal være egnede til både genetisk og farmakologisk forhør og kunne anvendes på tværs af cellemodeller af interesse. For at understøtte indsatsen for opdagelse af små molekyler skal analyser være meget følsomme, titrable, have en hurtig ekspeditionstid og være skalerbare til højkapacitetsformater, der er egnede til screening af forbindelser.

Generelt er DSBR tidligere blevet målt ved hjælp af fluorescensbaserede reporteranalysesystemer, der er stabilt integreret i cellegenomet6. Men mens fysiologisk rekapitulation af kromosomal DSBR er en klar fordel, er sådanne assays begrænset til en værtsmodel, hvor reporteren er integreret, bruger arbejdskrævende prøveforberedelse og analyse ved flowcytometri og har begrænset gennemstrømning, ekspeditionstid, robusthed og følsomhed, alle væsentlige funktioner, der er nødvendige for lægemiddelopdagelsesindsatsen.

Her beskriver vi en række DSBR-reporteranalyser, der gør det muligt at vurdere de fire store DSBR-veje. Pakken af reporteranalysesubstrater er skitseret i figur 1 og yderligere beskrevet i en nylig publikation7. De er ekstrakromosomale, hvilket tillader deres introduktion i celler ved simpel forbigående transfektion, og inkorporering af et nanoluciferase-reportergen8, som skal rekonstitueres ved engagement med specifikke DSBR-mekanismer, skaber følsomhed, robusthed og skalerbarhed. Følgende DSBR-reporter-substratvarianter er inkluderet i protokollen (figur 1):

Resektionsuafhængig MMEJ: Dette lineære substrat er sammensat af en kerne dobbeltstrenget DNA (dsDNA) region med enkeltstrenget DNA (ssDNA) udhæng, som efterligner resekeret DNA-ender9. Fire nukleotidmikrohomologier ved terminalerne af ssDNA-regionerne koder for startkodonet for reportergenet. Reparation af dette substrat gennem MMEJ gendanner reportergenets åbne læseramme (ORF).

Resektionsafhængig MMEJ: Det N-terminale reportergenexon afbrydes af et segment, der indeholder et stopkodon, som er flankeret af 8 basepar (bp) mikrohomologier. Nukleolytisk enderesektion er påkrævet før MMEJ-medieret reparation for at genoprette det intakte reportergen.

Stump NHEJ: Reportergenet er opdelt i N- og C-terminale sektioner, hvoraf sidstnævnte er placeret opstrøms for promotoren. DSB er produceret ved hjælp af EcoRV, og det kræver direkte ligering (uden slutbehandling) af NHEJ for at både reportergendele kan genforenes og reporter-ORF gendannes.

Ikke-stump NHEJ: DSB er placeret i en intron og vil have sammenhængende eller ikke-sammenhængende ender afhængigt af valget af restriktionsenzym. Reparationen af dette substrat af NHEJ kræver, at ligering går forud for slutbehandling.

Lang skabelon HR: Den N-terminale exon af reportergenet afbrydes af et DNA-segment indeholdende restriktionssteder, som erstatter 22 bp af den oprindelige reportergensekvens. For at gendanne denne sekvens bruger reparation af HR 2,5 kilobase (kb) homologiskabelonen placeret nedstrøms for C-terminal-exonen.

Kort skabelon HR: Det restriktionssted, der er nødvendigt for at generere DSB, erstatter en del af den oprindelige reportergensekvens og introducerer et stopkodon i billedet. Ligesom den lange skabelonversion kræver dette HR-substrat downstream-homologiskabelonen (360 bp) for nøjagtig reparation og restaurering af reporter-ORF’en.

SSA: Dette substrat indeholder et for tidligt stopkodon placeret i den N-terminale exon af reportergenet. Fjernelsen af dette stopkodon og genindsættelse af den intakte reportergensekvens kræver reparation af SSA, som involverer tovejs langdistanceresektion før justering af homologierne.

Til generering af DSB kan nogle af reportersubstraterne fordøjes med I-SceI (figur 1). Dette vil generere et lineært substrat med ikke-sammenhængende ender i den resektionsafhængige MMEJ, ikke-stumpe NHEJ, lange skabeloner HR og SSA-reportere, som har tandem I-Sce I-stederi omvendte retninger. I den korte skabelon HR-reportersubstrat vil fordøjelsen af det enkelte I-Sce I-webstedgenerere sammenhængende ender. De ikke-stumpe NHEJ, resektionsafhængige MMEJ, lange skabelon HR og SSA-plasmider kan også fordøjes med HindIII, som vil producere komplementære sammenhængende ender.

Vi leverer protokoller til generering af reporter-assaysubstraterne og beskriver, hvordan analyserne kan udføres, og giver detaljer om, hvordan de kan bruges til at kvantificere DSBR, herunder titrerbare responser på små molekyler, vurdering af cellulær styrke, aktivitet på mål og pathway-selektivitet.

Protocol

1. Forberedelse og kvalitetskontrol (QC) af reportersubstrater BEMÆRK: Plasmiderne, der koder for reportersubstraterne, kan formeres i standard Escherichia coli-stammer (f.eks. DH5α og derivater) og genvindes ved plasmidisolering. Plasmiddetaljer (størrelse og antibiotikaresistens) er beskrevet i tabel 1 og figur 1. Figur 1: Skemaer over ekstrakromosomale NanoLuc-baserede DSBR-reporteranalyser. Skematisk repræsentation af DSBR-reportersubstrater, herunder deres placering i hvert kildeplasmid, hovedsekvensfunktioner og endeligt layout efter stispecifik reparation. Den resektionsuafhængige MMEJ-substratkerne udskæres fra kildeplasmidet ved fordøjelse med XhoI/HindIII, hvorefter hætter skal ligeres til begge ender for at producere substratet til MMEJ. Det stumpe NHEJ-reportersubstrat genereres ved excision fra kildeplasmidet med EcoRV. De resektionsafhængige MMEJ-, ikke-stumpe NHEJ-, langskabelon-HR- og SSA-reportersubstrater genereres ved linearisering af kildeplasmiderne ved hjælp af enten I-SceI (som producerer ikke-sammenhængende ender) eller HindIII (som producerer sammenhængende ender). Den korte skabelon HR-reportersubstrat genereres ved linearisering af kildeplasmidet ved hjælp af I-SceI (som producerer sammenhængende ender). Reparation af hvert reportersubstrat ved hjælp af DSBR-målvejen rekonstituerer en intakt nanoluciferase ORF, der koder for funktionel NanoLuc. Denne figur blev tilpasset fra Rajendra et al.7. Forkortelser: DSBR = reparation af brud på dobbeltstreng; NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; NHEJ = ikke-homolog endesammenføjning; HR = homolog rekombination; SSA = enkeltstrenget udglødning ORF = åben læseramme. Klik her for at se en større version af denne figur. Fremstilling af resektionsuafhængigt MMEJ-reportersubstrat (Figur 1 og Figur 2A-C)Fremstilling af ssDNA/dsDNA-hætter (figur 2A)Resuspender de fire oligonukleotider, der er anført i tabel 2 , individuelt i udglødningsbuffer (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl i molekylærbiologisk vand) for at generere en stamopløsning ved 100 μM. Udglødning af ss/dsDNA hætterHver af de lange og korte oligonukleotider (100 μM stamopløsning) blandes 50 μL til venstre hætte fra trin 1.1.1.1 i et 0,2 ml rør. Gentag for højre hætte oligonukleotider. Ved hjælp af en termocykler inkuberes hver oligonukleotidblanding ved 99 °C i 5 minutter, og rampes derefter ned til 10 °C ved 1 °C/min.BEMÆRK VENLIGST: Dette vil producere de udglødede venstre og højre hætter. (QC, valgfrit) Verifikation af oligonukleotidudglødning ved elektroforeseElektroforese 100 ng af hvert produkt fra trin 1.1.1.2 sammen med individuelle oligonukleotider fra trin 1.1.1.1 og en DNA-stige med lav molekylvægt i en 20 % acrylamid-Tris-Borate-EDTA (TBE) gel ved 200 V i 80 minutter. Farv gelen med TBE-løbende buffer indeholdende et passende fluorescerende DNA-farvestof til visualisering af både ssDNA og dsDNA i mindst 10-15 minutter. Visualiser fluorescens på et geldokumentationssystem (figur 2A).BEMÆRK VENLIGST: Trin 1.1.1.3.1 til 1.1.1.3.3 bruges til at kontrollere, at hætterne er korrekt udglødet. De tilsyneladende størrelser for venstre hætte og højre hætte skal være henholdsvis ~120 bp og ~175 bp. Oprensning af reportersubstratkernen (figur 2B)Bland 100 μg af reporterkerneplasmidet med 4 μL HindIII og 4 μL XhoI (4 U/μg plasmid for hvert enzym) og 20 μL 10x buffer. Bring det samlede volumen til 200 μL med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og inkuber ved 37 °C i 2 timer til natten over for at fordøje plasmid.BEMÆRK VENLIGST: Til fordøjelse af større eller mindre mængder skaleres reaktionen proportionalt. Inkuber fordøjelsesreaktionen ved 80 °C i 20 minutter for at opvarme, inaktivere restriktionsenzymer. Reaktionsblandingen tilsættes 40 μL alkalisk fosfatase (2 U/μg plasmid) og 27 μL 10x buffer til reaktionsblandingen fra trin 1.1.2.2. Inkuber ved 37 °C i 2 timer for at defosforylere plasmidet.BEMÆRK VENLIGST: Skaler reaktionen op eller ned efter behov. Der tilsættes 60 μL 6x belastningsfarvestof til reaktionen fra trin 1.1.2.3. Elektroforese sammen med en højmolekylær DNA-stige i en 1,5 % (w/v) agarose-tris-acetat-EDTA (TAE) gel indeholdende en fluorescerende dsDNA-farvning ved 120 V i 2,5 timer, eller indtil båndene er tilstrækkeligt opløst. Visualiser fluorescens på et geldokumentationssystem (figur 2B). Fjern reporterkernefragmentet (~1,5 kb) fra gelen ved hjælp af en ren skalpel, og pas på ikke at forurene med vektorrygrad (~2,5 kb). Uddrag reporterkernefragmentet ved hjælp af et gelekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger. Mål DNA-koncentrationen og -kvaliteten (A260/280) ved hjælp af spektrofotometri. Ligering af reportersubstratkerne med ssDNA/dsDNA-hætter og oprensning af slutreportersubstrat (figur 2C)Bland 30 μg af reporterkernefragmentet fra trin 1.1.2.7 med 3,85 μL af hver udglødet venstre og højre hætte fra trin 1.1.2 (ca. 6:1 molforhold af cap:core DNA), 30 μL 10x ligasebuffer og 1,5 μL T4 DNA-ligase (20 U/μg DNA). Bring det samlede volumen af reaktionen til 300 μL med ddH2O og inkuber natten over ved 16 °C til ligathætter til reporterkernefragmentet.BEMÆRK VENLIGST: Skaler reaktionen op eller ned efter behov. (QC, valgfrit) Elektroforese 200 ng af det resulterende produkt fra trin 1.1.3.1 sammen med reportersubstratekernen og en DNA-stige med høj molekylvægt i en 0,7 % (w/v) agarose-TAE-gel indeholdende en fluorescerende dsDNA-farvning ved 120 V i mindst 1,5 time. Kontroller, at båndet, der svarer til det ligerede produkt, migrerer lidt langsommere end den ikke-ligerede reportersubstratkerne (figur 2C).BEMÆRK: Dette QC-trin er at kontrollere, at ligeringen af hætter til reporterkernefragmentet har fundet sted korrekt. DNA’et renses fra fordøjelsesreaktionen i trin 1.3.1. ved hjælp af den foretrukne metode (f.eks. en perlebaseret eller søjlebaseret metode) efter producentens anvisninger.BEMÆRK VENLIGST: Rensningstrin 1.1.3.3 reducerer tilstedeværelsen af ikke-ligerede hætter betydeligt. Mål DNA-koncentration og -kvalitet (A260/280) ved spektrofotometri. Forberedelse af stump NHEJ-reportersubstrat (figur 1 og figur 2D,E)Bland 100 μg af reporterkerneplasmidet med 5 μL EcoRV (5 U/μg plasmid) og 20 μL 10x buffer. Bring det samlede volumen til 200 μL med ddH2O og inkuber ved 37 °C i 2 timer til natten over for at fordøje plasmid.BEMÆRK VENLIGST: Til fordøjelse af større eller mindre mængder skaleres reaktionen proportionalt. Inkuber fordøjelsesreaktionen ved 65 °C i 20 minutter for at opvarme, inaktivere restriktionsenzymet. Tilsæt 50 μL 6x belastningsfarvestof til reaktionen fra trin 1.2.2. Elektroforese sammen med en DNA-stige med høj molekylvægt i en 1,5 % (w/v) agarose-TAE-gel indeholdende en fluorescerende dsDNA-farvning ved 120 V i 2 timer, eller indtil båndene er tilstrækkeligt opløst. Visualiser fluorescens på et geldokumentationssystem (figur 2D). Rens reportersubstratet (~1,7 kb) fra gelen ved hjælp af en ren skalpel, og pas på ikke at forurene med vektorrygraden (~2,6 kb). Udtræk reporterkernefragmentet ved hjælp af et gelekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger (figur 2E). Mål DNA-koncentrationen og -kvaliteten (A260/280) ved hjælp af spektrofotometri. Forberedelse af I-SceI-baserede reportersubstrater (figur 1)BEMÆRK: Disse substrater omfatter resektionsafhængig MMEJ (Figur 2F), ikke-stump NHEJ (Figur 2G), lang skabelon HR (Figur 2H), kort skabelon HR (Figur 2I) og SSA (Figur 2J).Bland 100 μg af reporterkerneplasmidet med 50 μL I-SceI (5 U/μg plasmid) og 60 μL 10x buffer. Bring det samlede volumen til 600 μL med ddH2O og inkuber ved 37 °C i 2 timer til natten over for at fordøje plasmid.BEMÆRK VENLIGST: Til fordøjelse af større eller mindre mængder skaleres reaktionen proportionalt. Ikke-stumpe NHEJ, resektionsafhængige MMEJ, lange skabelon-HR og SSA-plasmider kan også fordøjes med HindIII, som vil generere komplementære sammenhængende ender. Inkuber fordøjelsesreaktionen ved 65 °C i 20 minutter for at varmeinaktivere I-SceI. Indstil temperaturen til 80 °C under dette trin, hvis HindIII blev brugt til fordøjelse i stedet. DNA renses fra den inaktiverede fordøjelsesreaktion i trin 1.3.2 ved hjælp af den foretrukne metode (f.eks. en perlebaseret eller søjlebaseret metode) efter producentens anvisninger. Mål DNA-koncentrationen og renheden A260/280) ved hjælp af spektrofotometri. Kvalitetskontrol af reportersubstraterElektroforese 200 ng af reportersubstratet sammen med en DNA-stige med høj molekylvægt i en 0,7 % (w/v) agarose-TAE-gel indeholdende en fluorescerende dsDNA-farvning ved 120 V i 2 timer, eller indtil båndene er tilstrækkeligt opløst. Læg det originale uklippede reporterplasmid ved siden af som en kontrol. Kontroller, at de definerede bånd af den korrekte størrelse overholdes for hvert reportersubstrat (se tabel 1 og figur 2F-J). Figur 2: Gelelektroforetiske analyser af DSBR-reportersubstratgenerering. (A-C) Repræsentative billeder fra gelelektroforetisk analyse af mellemprodukter og endelig konstruktion, der kræves til generering af det resektionsuafhængige MMEJ-reportersubstrat. De tilstødende billeder i panel (A) og (C) er fra de samme geler; irrelevante baner er blevet udeladt. (D,E) Repræsentative billeder fra gelelektroforetisk analyse for kildeplasmid, EcoRV-fordøjede produkter og gel-ekstraheret endelig konstruktion, der kræves til generering af det stumpe NHEJ-reportersubstrat. (F-J) Repræsentative billeder fra gelelektroforetisk analyse af kildeplasmider og lineariserede DSBR-konstruktioner for de I-SceI-fordøjede reportersubstrater: resektionsafhængig MMEJ, ikke-stump NHEJ, lang skabelon HR, kort skabelon HR, SSA. Forkortelser: DSBR = reparation af brud på dobbeltstreng; MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; NHEJ = ikke-homolog endesammenføjning; HR = homolog rekombination; SSA = enkeltstrenget udglødning. Klik her for at se en større version af denne figur. 2. Forbigående transfektion af DSBR-reportersubstrater BEMÆRK: En oversigt over den eksperimentelle arbejdsgang for assays og nogle potentielle permutationer er skitseret i figur 3. Protokollen nedenfor beskriver et eksperiment med HEK-293-celler, hvor disse er omvendt transfekteret med reportersubstratet. Tallene nedenfor kan skaleres op eller ned i henhold til antallet af brønde, der skal bruges pr. plade. Følgende trin beregnes for en analyse udført i en plade med 96 brønde; se Diskussion for yderligere overvejelser. Figur 3: Eksperimentel arbejdsgang for DSBR-reporteranalyser. Celler af interesse transfekteres med det lineariserede DSBR-substrat (der koder for en NanoLuc ORF, der skal repareres gennem en specifik DNA-reparationshændelse) og et Firefly-plasmid (transfektionskontrol). Derefter, 6-24 timer efter transfektion, kan Firefly-luminescensen og NanoLuc-luminescensen læses sekventielt efter tilsætning af Nano-Glo Dual-Luciferase reagenser. Eksempler på permutationer til kernetrinene (vist i lyseblå bokse) kan bruges til at teste, hvordan genetisk modulation (knockout, knockdown eller overekspression) eller farmakologisk behandling påvirker DSBR-vejens færdigheder i celler. Forkortelser: DSBR = reparation af brud på dobbeltstreng; NanoLuc = Nanoluciferase; WT = vild type; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur. (Valgfrit) Hvis man vurderer forbindelsernes indvirkning på reporteranalysen, dispenseres forbindelser opløst i vehikel (f.eks. dimethylsulfoxid [DMSO]) i brønde på en 96-brønds plade i henhold til et foruddefineret eksperimentelt layout. Normaliser køretøjskoncentrationen på tværs af alle brønde.BEMÆRK: Tekniske replikater anbefales. Inkluder kontrolbrønde (f.eks. kun køretøj). I et 1,5 ml rør fortyndes Firefly-kontrolplasmid (kontrolluciferase) og NanoLuc DSBR-reportersubstrat (reporter luciferase) genereret i trin 1.1, 1.2 eller 1.3 i 500 μL transfektionsbuffer. Brug 0,66 μg kontrol luciferaseplasmid pr. 1 × 106 celler. Se tabel 3 for de mængder af NanoLuc DSBR reportersubstrat, der skal bruges.BEMÆRK VENLIGST: Et positivt kontrolplasmid, der konstitutivt udtrykker reporterluciferasen, kan bruges til at validere instrumentopsætning og transfektionsbetingelser eller til at kontrollere for uspecifikke virkninger på selve reporterluciferasen. Som udgangspunkt anbefaler vi 0,1 μg reporter luciferaseplasmid og 0,66 μg kontrolluciferaseplasmid pr. 1 × 106 celler. Tilsæt lipidbaseret transfektionsreagens til det fortyndede DNA fra trin 2.2 i et producentens anbefalede forhold (f.eks. 1:2, μg DNA:μL-reagens for reagenset beskrevet i materialetabellen), bland godt ved at hvirvle kort, og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Høst celler ved trypsinisering, resuspender dem i frisk medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), og tæl dem. Overfør 3 × 106 celler til et 15 ml rør og opresuspender i 8,5 ml medium. Tilsæt DNA-transfektionsblandingen fra trin 2.3 i cellesuspensionen og bland flere gange ved inversion. Plade 80 μL cellesuspension (ca. 2,7 × 104 celler) pr. brønd.BEMÆRK VENLIGST: Suspensionen indeholdende celler og DNA-transfektionsblanding kan dispenseres på pladen enten ved at pipettere manuelt eller ved hjælp af en automatiseret væskebehandler til eksperimenter med højere kapacitet. Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 24 timer. 3. Påvisning af luminescens Fremstilling af reagenserFølg producentens anvisninger for fremstilling og tilsætning af reporter (NanoLuc) og kontrol (Firefly) luciferasere, som udgør substraterne for begge luciferaser (henholdsvis Furimazin og 5′-Fluoroluciferin): Forbered kontrol luciferasereagens. Rekonstitueres i henhold til producentens anvisninger, og der blandes ved invertering, indtil luciferasesubstratet er grundigt opløst. Forbered frisk reporter luciferasereagens i henhold til producentens anvisninger. Beregn den mængde reagens, der er nødvendig for at tilsætte 80 μL/brønd, og tilføj substrat til et passende volumen af analysebuffer i forholdet 1:100 (luciferasesubstrat:buffer). For en 96-brønds plade fortyndes 88 μL luciferasesubstrat til 8.800 μL buffer og blandes ved inversion.BEMÆRK: Disse mængder inkluderer en ca. 10% selvrisiko. Når det er rekonstitueret, kan kontrolluciferasereagenset opbevares i henhold til producentens anvisninger til fremtidig brug. Reporter luciferasereagenset skal tilberedes frisk til hver anvendelse. Seriel detektion af luminescens fra kontrol- og reporterluciferaser (96-brønds plade)Lad pladen og luciferasereagenserne nå stuetemperatur. Tilsæt 80 μL kontrolluciferasereagens pr. brønd. Ryst pladen i 3 minutter på en orbital ryster ved 450 omdr./min. Mål kontrolluciferaseluminescenssignalet med en luminescenspladelæser.BEMÆRK VENLIGST: Aflæs emission ved 580 nm (80 nm båndpasfilter) eller den samlede luminescens pr. brønd. Denne luminescens bruges som et mål for transfektionseffektivitet og celletæthed og kan også informere om cellulær toksicitet forårsaget af testbehandlingerne. Tilsæt 80 μL reporter luciferasereagens pr. brønd.BEMÆRK VENLIGST: Dette reagens vil hæmme kontrolluciferasen; Den indeholder også substratet til reporteren Luciferase. Ryst pladen i 3 minutter på en orbital ryster ved 450 omdr./min. Lad pladen hvile i 7 minutter ved stuetemperatur. Mål reporterluciferaseluminescenssignalet med en luminescenspladelæser.BEMÆRK VENLIGST: Aflæseemission ved 470 nm (80 nm båndpasfilter) eller alternativt total luminescens pr. brønd. Denne luminescens giver information om mængden af reportersubstrat, der er blevet repareret af DSBR-vejen af interesse. Eksporter luminescensaflæsninger til downstream-analyse. 4. Analyse af data Divider reporter luciferase (NanoLuc) luminescenssignalet med kontrolluciferase (Firefly) luminescenssignalet, der stammer fra den samme brønd for at beregne analysesignalet. Anvend denne beregning på alle brøndene som vist i ligning (1).(1) Beregn gennemsnittet af analysesignalerne for kontrolbrøndene (f.eks. kun køretøj). Normaliser analysesignalerne for testbrønde til kontrolbrøndgennemsnittet ved hjælp af ligning (2) for at beregne reparation (%) pr. brønd. (2) (Valgfrit, kurvetilpasning) Hvis der testes flere sammensatte doser, skal du plotte den beregnede reparation (%) i forhold til den sammensatte koncentration og tilpasse en dosis-responskurve ved hjælp af en ikke-lineær regressionsmodel. Brug denne kurve til efterfølgende EC50-interpolation .

Representative Results

Reparation af hvert af indberetteranalyserne kan påvises og kvantificeres ved hjælp af samme procedure. Korrekt reparation af et substrat ved dets beslægtede reparationsvej i celler vil rekonstruere en intakt, funktionel ORF, der koder for NanoLuc. Dette luminescenssignal kan detekteres ved hjælp af en pladelæser. Co-transfektionen med et intakt plasmid, der koder for Firefly luciferase, fungerer som en transfektionskontrol. Denne kontrol tjener to formål. For det første giver det en standard til at normalisere NanoLuc-signalet til, da det skal være uforstyrret af modulering af DSBR med enten genetiske eller farmakologiske midler. For det andet kan det give en indikation af cellulære forstyrrelser uden for målet, der påvirker luciferase-signalet, såsom cellecyklusmodulering, virkninger på transkription/translation eller generel toksicitet. Forholdet mellem NanoLuc og Firefly fungerer som en surrogataflæsning af reparation. Luminescensværdier kan eksporteres og analyseres ved at normalisere de to luciferase-signaler inde fra den samme brønd. I tilfælde af genetiske forstyrrelsesundersøgelser (f.eks. sammenligning af vildtype og KO eller ikke-målrettede og mål-siRNA) normaliseres reparationen normalt til forældreprøven (vildtypeceller eller celler behandlet med ikke-målrettede kontrol-siRNA). I tilfælde af farmakologisk modulering normaliseres værdier fra en sammensat prøve til den værdi, der frembringes ved vehikelbehandling. Fuld validering af den beskrevne reporterpakke er for nylig blevet offentliggjort7. Data, der eksemplificerer karakteriseringen af genetisk og farmakologisk modulering af DSBR, er vist i figur 4 (tilpasset fra 7). Polθ er den vigtigste mediator af MMEJ, og tab eller hæmning af dette enzym forudsiges specifikt at ablatere cellulær MMEJ 3,10. Ved hjælp af en cellelinje, hvor POLQ, genet, der koder for Polθ, er blevet slået ud11, viser den resektionsuafhængige MMEJ-reporteranalyse, at MMEJ faktisk er næsten fuldt undertrykt. Evaluering af komponenten NanoLuc og Firefly-luminescenssignaler viser, at den observerede reparationsdefekt er drevet af en reduktion i NanoLuc-signalet (kodet af reportersubstratet), mens Firefly-signalet (kontrol) er uforstyrret (figur 4A-C). I modsætning hertil viser vurderingen af NHEJ-færdigheder ved hjælp af den stumpe ende NHEJ-reporter, at POLQ-knockout ikke hæmmer reparationen af reportersubstratet (figur 4D-F). Tilsammen understøtter disse genetiske data Polθs specifikke rolle i MMEJ-medieret reparation. Disse observationer er fuldt rekapituleret farmakologisk med ART55812,13, en nyligt rapporteret meget potent og specifik hæmmer af polymerasedomænet af Polθ (figur 4G), hvor titrerbar hæmning af MMEJ er observeret, som stammer fra et specifikt fald i NanoLuc og ikke Firefly-signalet (figur 4H). Ydermere, og i overensstemmelse med genetiske data, er der ingen effekt på NHEJ (figur 4I,J). Tilsammen fremhæver disse data, hvordan disse reportere kan bruges til at karakterisere den genetiske modulering af DSBR-veje og vise cellulær styrke og mål/vejspecificitet af små molekyler. Figur 4: Virkninger af genetisk knockout og farmakologisk hæmning af Polθ på MMEJ- og NHEJ-reportersignaler. eHAP1 WT- og POLQ(-) -celler blev transfekteret med et Firefly-kontrolplasmid og med (A-C) den resektionsuafhængige MMEJ-reporter eller (D-F) stump end NHEJ-reporter. Procentdel af MMEJ- eller NHEJ-reparation er forholdet mellem NanoLuc-luminescens og Firefly-luminescens, normaliseret til den DMSO-behandlede kontrol, 24 timer efter transfektion. Data repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre biologiske replikater, hver gennemsnitligt 8 tekniske replikater. HEK-293-celler blev transfekteret med et Firefly-kontrolplasmid og (G,H) den resektionsuafhængige MMEJ-reporter eller (I,J) stumpe ende NHEJ-reporter og behandlet med Polθ-polymerasehæmmeren ART558. Procentdel af reparation er forholdet mellem NanoLuc-luminescens og Firefly-luminescens, normaliseret til den DMSO-behandlede kontrol, 24 timer efter transfektion. Procentvis hæmning af de enkelte luminescenssignaler i (G) og (I) blev beregnet i forhold til DMSO-behandlet kontrol og vist i henholdsvis (H) og (J). Data repræsenterer gennemsnittet ± SEM af 2 biologiske replikater, hver i gennemsnit 4 tekniske replikater. Denne figur blev tilpasset fra Rajendra et al.7. Forkortelser: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; NHEJ = ikke-homolog endesammenføjning; WT = vild type. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Hæmning af HR-reportersignal af RAD51-hæmmeren CAM833. (A) HEK-293-celler blev transfekteret med den lange skabelon HR-reportersubstrat, et Firefly luciferase-kontrolplasmid og behandlet med RAD51-hæmmeren CAM83314. NanoLuc og Firefly-luminescens blev aflæst 16 timer efter transfektion. Procentdel af HR-reparation er forholdet mellem NanoLuc-luminescens og Firefly-luminescens, normaliseret til den DMSO-behandlede kontrol. Stiplede linjer fremhæver procentvis HR-hæmning og CAM833-koncentration ved kurven EC50. Data repræsenterer gennemsnittet ± SEM af 2 biologiske replikater, hver i gennemsnit 4 tekniske replikater. (B) Procentvis hæmning af de individuelle luminescenssignaler i (A) blev beregnet i forhold til den DMSO-behandlede kontrol. Stiplede linjer fremhæver procentvis NanoLuc- og Firefly-hæmning ved 3,33 μM CAM833 (EC50). Faldet i Firefly-signalet ved CAM833-koncentrationer ≥ 10 μM er tegn på forbindelsestoksicitet ved høje doser; dog observeres NanoLuc-signalreduktion ved koncentrationer, hvor Firefly-signalet er upåvirket, hvilket tyder på, at CAM833 inducerer HR-hæmning på målet. Denne figur blev tilpasset fra Rajendra et al.7. Forkortelser: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = homolog rekombination. Klik her for at se en større version af denne figur. Reporter substrat Kilde plasmid(størrelse i kb, modstand) DSB-generering Forventet størrelse af den endelige rapportørs substrat (kb) Resektionsuafhængig MMEJ 4.0, Kan Resekteret 3′ haler gennem ligering af hætter 1.6 Resektionsafhængig MMEJ 6.5, Kan I-SceI (ikke-sammenhængende), HindIII (sammenhængende) 6.5 Stump NHEJ 4.3, Kan Stump slutter ved udskæring fra plasmid af EcoRV 1.7 Ikke-stump NHEJ 6.7, Kan I-SceI (ikke-sammenhængende), HindIII (sammenhængende) 6.5 Lang skabelon HR 9.2, Kan I-SceI (ikke-sammenhængende), HindIII (sammenhængende) 9.2 Kort skabelon HR 9,3, Amp I-SceI (sammenhængende) 9.3 SSA 9.5, Kan I-SceI (ikke-sammenhængende), HindIII (sammenhængende) 9.5 Tabel 1: Reportersubstratplasmider. Forkortelser: DSB = dobbeltstrengsbrud; MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; NHEJ = ikke-homolog endesammenføjning; HR = homolog rekombination; SSA = enkeltstrenget udglødning Kan = kanamycin; Amp = ampicillin. Sekvens (5′-3′) Leverandør Rensning Funktion 5′[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCCCCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT Sigma SIDE Venstre hætte, lang oligonukleotid 5′[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC Sigma SIDE Venstre hætte, kort oligonukleotid 5′[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGGGCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG Sigma SIDE Højre hætte, lang oligonukleotid 5′[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA Sigma SIDE Højre hætte, kort oligonukleotid Tabel 2: Oligonukleotider for hætter til generering af resektionsuafhængigt MMEJ-reportersubstrat. Forkortelser: ssDNA = enkeltstrenget DNA; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; PAGE = polyacrylamidgelelektroforese. Mikrohomologier er understreget. Reporter analyse NanoLuc reporter substrat DNA (μg DNA/1×106 celler) Ildflue kontrol luciferaseplasami (μg DNA/1×106 celler) Resektionsuafhængig MMEJ 0.5 0.66 Resektionsafhængig MMEJ 1 0.66 Stump NHEJ 0.5 0.66 Ikke-stump NHEJ 0.5 0.66 Lang skabelon HR 1 0.66 Kort skabelon HR 2 0.66 SSA 1 0.66 Tabel 3: DNA-mængder for forbigående transfektion af NanoLuc reportersubstrater og Firefly-kontrol luciferaseplasmid (HEK-293, 96-brønds pladeformat). Forkortelser: MMEJ = mikrohomologi-medieret endesammenføjning; NHEJ = ikke-homolog endesammenføjning; HR = homolog rekombination; SSA = enkeltstrenget udglødning.

Discussion

Her har vi beskrevet protokoller til generering og implementering af en række ekstrakromosomale luminescensbaserede reportere til måling af den cellulære færdighed af de fire store DSBR-veje (HR, NHEJ, MMEJ og SSA)7. Reportersubstrater kan introduceres i celler ved forbigående transfektion og bruges til at vurdere DSBR-aktivitet ved hjælp af en følsom og robust pladebaseret udlæsning af NanoLuc-luminescens, som rekonstitueres ved engagement med beslægtede cellulære DSBR-veje.

Flere stadier af generering af reportersubstrat, transfektion af substraterne til celler og datafortolkning er afgørende for en vellykket udførelse af disse analyser. Selvom standard molekylærbiologiske teknikker bruges til at generere reportersubstraterne, sikrer visualisering af processen ved gelelektroforese den højeste kvalitet og renhed af substraterne før transfektion. Da disse assays er afhængige af transient transfektion, gælder almindelige overvejelser for disse metoder. Disse omfatter optimering af såtæthed, transfektionsbetingelser (inklusive reagenser og DNA-mængder) og vurdering af egnethed i fremadgående og omvendte transfektionsformater. Disse reporteranalyser er blevet udført med succes med en række elektroporations- og lipofektionsprotokoller, og mulighederne bør undersøges fuldt ud, før disse analyser udføres. Der skal også udvises omhu for at inspicere komponentens NanoLuc- og Firefly-signaler i stedet for blot det sammensatte reparationssignal, der udledes ved at normalisere NanoLuc-signalet (reportersubstrat) til Firefly-signalet (kontrol). Artefakter kan opstå ved, at forholdet drives af ændringer i Firefly-signalet. For eksempel bør vurdering af hæmning i dosis-respons-tilstand ved hjælp af en meget specifik forbindelse undertrykke NanoLuc-signalet på en titrerbar måde uden at forstyrre Firefly-signalet, som bør forblive stabilt (figur 4G,H). I tilfælde, hvor Firefly-signaler forstyrres, kan nyttige virkninger på reparationen dog stadig bestemmes ved at identificere et dosisvindue, hvor Firefly-signalet er upåvirket (figur 5).

Sammenlignet med de mest anvendte DSBR-reporterassays har disse ekstrakromosomale luminescensbaserede reporterassays nogle klare fordele. Da DSBR-veje er meget bevarede, selvom cellulært maskineri varierer mellem cellemodeller, kan analyserne stadig rapportere om DSBR-færdigheder og vejvalg. Dette åbner op for vurderingen af DSBR for enhver model af interesse for brugeren, så længe optimale transiente transfektionsbetingelser er fastlagt på forhånd.

Brugen af Nanoluciferase som reportergen giver også fordele i forhold til fluorescerende muligheder, som traditionelt er blevet brugt i DSBR-reporteranalyser. NanoLuc modnes hurtigt, og luminescens detekteres med høj følsomhed ved hjælp af en pladelæser8. Koblet til hastigheden af substratreparation (da reportersubstraterne transfekteres til celler med DSB-ender, der er klar til reparation), er dette format af DSBR-reporteranalyse ideelt til den hurtige ekspedition og kvantitative robusthed, der kræves til screening af små molekyler som en del af en industriel lægemiddelopdagelseskaskade. Faktisk har vi for nylig beskrevet implementeringen af det resektionsuafhængige MMEJ-reporterassay i opdagelseskaskaden, der blev brugt til identifikation af små molekylehæmmere af Polθ-polymerasedomænet13.

Der er også fleksibilitet i implementeringen af reporteranalyserne for at behandle specifikke spørgsmål om genetiske og farmakologiske forstyrrelser af DSBR (figur 3). For eksempel kan celler før transfektion af reportersubstraterne transfekteres med siRNA mod et gen af interesse i 48-72 timer. Alternativt kan virkningerne af genoverekspression på DSBR-veje testes ved at udføre plasmidtransfektion 24-48 timer før transfektion af reportersubstrater. For farmakologiske undersøgelser beskriver denne protokol allerede, hvordan brugen af små molekyler kan inkorporeres i standardarbejdsgangen, men alternative formater kan omfatte ændringer i behandlingsregimer, såsom præ-inkubationer eller udvaskninger.

Skalerbarheden af transient transfektion kan også understøtte screeningstilgange i stor skala, hvor batchtransfektion af reportersubstrater udføres før screening. Desuden kan varigheden af analysen fra transfektion til udlæsning også varieres. Selvom standardvarigheden kan være 16-24 timer, kan nogle analyser læses op på så lidt som 6 timer7. Bekymringer over toksicitet fra små molekyler eller siRNA, der kan kompromittere cellernes levedygtighed, bør også overvejes ved bestemmelse af analysevarigheden.

Sammenfattende giver de analyser, der er skitseret i denne undersøgelse og fuldt beskrevet i en nylig publikation7 , en hurtig og robust vurdering af cellulær DSBR-færdighed. De er meget følsomme og titrable, hvilket gør dem modtagelige for både genetiske og farmakologiske undersøgelser. Det er afgørende, at da reportersubstraterne kan introduceres i celler ved forbigående transfektion, har de potentialet til at blive brugt i enhver transfekterbar cellemodel af interesse, snarere end at være begrænset til specifikke cellelinjer ved stabil integration, som det er tilfældet med kromosomale DSBR-reportere. En klar begrænsning ved disse reporter-ekstrakromosomale assays er imidlertid, at manglen på integration i genomet måske ikke fuldt ud rekapitulerer den fysiologiske, kromatinerede kontekst for DNA-reparation og dens tilhørende regulatoriske signaler og orkestrering15. Til dette formål er ekstrakromosomale reporteranalyser komplementære til eksisterende metoder til DSBR-vurdering og udvider værktøjskassen af ressourcer, der er egnede til både grundforskning og lægemiddelopdagelse.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alt arbejde blev finansieret af Artios Pharma Ltd. Figur 1 og figur 3 blev skabt med Biorender.com.

Materials

10x TBE buffer Thermo Fisher AM9863
20% TBE-acrylamide gel Invitrogen EC6315BOX
50x TAE buffer Fisher Scientific BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple NEB B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid) Porvair 204012
Agarose Cleaver Scientific CSL-AG500
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 For bead-based purification of DNA
Antarctic phosphatase and 10X buffer NEB M0289L
CLARIOstar BMG Labtech 430-101 Plate reader
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX1000 Cell counter
Custom oligonucleotides Sigma-Aldrich Custom order For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2.
D300e Tecan 30100152 DMSO-based compound dispenser
D300e D4+ cassette Tecan 30097371 High volume cassette for D300e compound dispenser
D300e T8+ cassette Tecan 30097370 Low volume cassette for D300e compound dispenser
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade Sigma-Aldrich D2650-100ML Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5
DSBR reporter source plasmids Artios Available to the academic community upon request 
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer NEB R3195M
Ethanol absolute VWR 20821.365
Foetal Bovine Serum PAN-Biotech P30-3031 
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder Thermo Fisher SM1211 Low molecular weight DNA ladder
HEK-293 cells ATCC CRL-1573 Example cell line used in protocol
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer NEB R3104M
HyClone Molecular Biology grade water Fisher Scientific 10275262
I-SceI and 10x Tango Buffer Invitrogen ER1771
Isopropanol VWR 20842.33
JetPRIME reagent and buffer PolyPlus 114-15 Lipid-based transfection reagent
MegaStar 1.6 VWR 521-1749 Centrifuge for 15 or 50 mL tubes
MEM Eagle PAN-Biotech P04-08056 Culture medium for HEK-293 cells
Microplate shaker Fisherbrand 15504070 Microplate orbital shaker
MicroStar 17R VWR 521-1647 Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes
MultiDrop Thermo Fisher 5840300 Cell or water-based reagent dispenser
MultiDrop Standard Cassette Thermo Fisher 24072670 Cassette for MultiDrop reagent dispenser
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate Promega N1630 or N1650 Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate Promega N1630 or N1650 Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (without calcium or magnesium) PAN-Biotech P04-36500
pGL4 Firefly plasmid (or similar) Promega E1310 (or equivalent) Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) Promega N1091 (or equivalent) NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder NEB N0552S High molecular weight DNA ladder
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Thermo Fisher AM9740 For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10,000x) Invitrogen S11494 For visualisation of ssDNA and dsDNA
SYBR Safe (10,000x) Invitrogen S33102 For visualisation of dsDNA only
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer NEB M0202L
Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen T10282 For measurement of viability during cell counting
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA Sigma-Aldrich T4049-100ML
XhoI and 10x CutSmart buffer NEB R0146M

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
  4. Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
  5. van de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
  7. Rajendra, E., et al. titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
  8. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  9. Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
  10. Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
  11. Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
  12. Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
  13. Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
  14. Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).
  15. Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).

Play Video

Cite This Article
Grande, D., Rajendra, E., Mason, B., Galbiati, A., Boulton, S. J., Smith, G. C. M., Robinson, H. M. R. Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays. J. Vis. Exp. (208), e66969, doi:10.3791/66969 (2024).

View Video