Vi præsenterer protokoller til vurdering af dobbeltstrengsbrudsreparationsvejens færdigheder i celler ved hjælp af en række luminescensbaserede ekstrakromosomale reportersubstrater.
Reparation af DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB’er) er afgørende for opretholdelsen af genomstabilitet og cellelevedygtighed. DSB-reparation (DSBR) i celler medieres gennem flere mekanismer: homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ) og enkeltstrenget udglødning (SSA). Cellulære assays er afgørende for at måle færdighederne og moduleringen af disse veje som reaktion på forskellige stimuli.
Her præsenterer vi en række ekstrakromosomale reporteranalyser, der hver måler rekonstitutionen af et nanoluciferase-reportergen ved en af de fire store DSBR-veje i celler. Ved forbigående transfektion til celler af interesse kan reparation af vejspecifikke reportersubstrater måles på under 24 timer ved påvisning af Nanoluciferase (NanoLuc) luminescens.
Disse robuste assays er kvantitative, følsomme, titrerbare og modtagelige for et screeningsformat med høj kapacitet. Disse egenskaber giver brede anvendelser inden for DNA-reparationsforskning og lægemiddelopdagelse, der supplerer den aktuelt tilgængelige værktøjskasse af cellulære DSBR-analyser.
DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB’er) repræsenterer en særlig giftig klasse af DNA-skader1, på grund af hvilken celler har udviklet flere DSB-reparationsveje (DSBR) til at reparere disse læsioner. De fire vigtigste DSBR-mekanismer er homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ) og enkeltstrengsudglødning (SSA)2,3. DSBR-veje bidrager til opretholdelsen af sund vævsudvikling og fysiologi og beskytter mod sygdomme som kræft. Desuden rummer disse reparationsmekanismer terapeutisk potentiale for udvikling af små molekylemodulatorer inden for præcisionsonkologi. For eksempel har målretning mod DNA-polymerase θ (Polθ), et centralt enzym i MMEJ-reparationsvejen, tiltrukket sig interesse på grund af dets syntetiske dødelighed med HR-mangel i kræft4.
Forståelse af DSBR har derfor brede kliniske implikationer, og funktionelle cellulære assays, der er i stand til at måle aktiviteten af alle de store DSBR-veje, er nødvendige5. Assays skal være egnede til både genetisk og farmakologisk forhør og kunne anvendes på tværs af cellemodeller af interesse. For at understøtte indsatsen for opdagelse af små molekyler skal analyser være meget følsomme, titrable, have en hurtig ekspeditionstid og være skalerbare til højkapacitetsformater, der er egnede til screening af forbindelser.
Generelt er DSBR tidligere blevet målt ved hjælp af fluorescensbaserede reporteranalysesystemer, der er stabilt integreret i cellegenomet6. Men mens fysiologisk rekapitulation af kromosomal DSBR er en klar fordel, er sådanne assays begrænset til en værtsmodel, hvor reporteren er integreret, bruger arbejdskrævende prøveforberedelse og analyse ved flowcytometri og har begrænset gennemstrømning, ekspeditionstid, robusthed og følsomhed, alle væsentlige funktioner, der er nødvendige for lægemiddelopdagelsesindsatsen.
Her beskriver vi en række DSBR-reporteranalyser, der gør det muligt at vurdere de fire store DSBR-veje. Pakken af reporteranalysesubstrater er skitseret i figur 1 og yderligere beskrevet i en nylig publikation7. De er ekstrakromosomale, hvilket tillader deres introduktion i celler ved simpel forbigående transfektion, og inkorporering af et nanoluciferase-reportergen8, som skal rekonstitueres ved engagement med specifikke DSBR-mekanismer, skaber følsomhed, robusthed og skalerbarhed. Følgende DSBR-reporter-substratvarianter er inkluderet i protokollen (figur 1):
Resektionsuafhængig MMEJ: Dette lineære substrat er sammensat af en kerne dobbeltstrenget DNA (dsDNA) region med enkeltstrenget DNA (ssDNA) udhæng, som efterligner resekeret DNA-ender9. Fire nukleotidmikrohomologier ved terminalerne af ssDNA-regionerne koder for startkodonet for reportergenet. Reparation af dette substrat gennem MMEJ gendanner reportergenets åbne læseramme (ORF).
Resektionsafhængig MMEJ: Det N-terminale reportergenexon afbrydes af et segment, der indeholder et stopkodon, som er flankeret af 8 basepar (bp) mikrohomologier. Nukleolytisk enderesektion er påkrævet før MMEJ-medieret reparation for at genoprette det intakte reportergen.
Stump NHEJ: Reportergenet er opdelt i N- og C-terminale sektioner, hvoraf sidstnævnte er placeret opstrøms for promotoren. DSB er produceret ved hjælp af EcoRV, og det kræver direkte ligering (uden slutbehandling) af NHEJ for at både reportergendele kan genforenes og reporter-ORF gendannes.
Ikke-stump NHEJ: DSB er placeret i en intron og vil have sammenhængende eller ikke-sammenhængende ender afhængigt af valget af restriktionsenzym. Reparationen af dette substrat af NHEJ kræver, at ligering går forud for slutbehandling.
Lang skabelon HR: Den N-terminale exon af reportergenet afbrydes af et DNA-segment indeholdende restriktionssteder, som erstatter 22 bp af den oprindelige reportergensekvens. For at gendanne denne sekvens bruger reparation af HR 2,5 kilobase (kb) homologiskabelonen placeret nedstrøms for C-terminal-exonen.
Kort skabelon HR: Det restriktionssted, der er nødvendigt for at generere DSB, erstatter en del af den oprindelige reportergensekvens og introducerer et stopkodon i billedet. Ligesom den lange skabelonversion kræver dette HR-substrat downstream-homologiskabelonen (360 bp) for nøjagtig reparation og restaurering af reporter-ORF’en.
SSA: Dette substrat indeholder et for tidligt stopkodon placeret i den N-terminale exon af reportergenet. Fjernelsen af dette stopkodon og genindsættelse af den intakte reportergensekvens kræver reparation af SSA, som involverer tovejs langdistanceresektion før justering af homologierne.
Til generering af DSB kan nogle af reportersubstraterne fordøjes med I-SceI (figur 1). Dette vil generere et lineært substrat med ikke-sammenhængende ender i den resektionsafhængige MMEJ, ikke-stumpe NHEJ, lange skabeloner HR og SSA-reportere, som har tandem I-Sce I-stederi omvendte retninger. I den korte skabelon HR-reportersubstrat vil fordøjelsen af det enkelte I-Sce I-webstedgenerere sammenhængende ender. De ikke-stumpe NHEJ, resektionsafhængige MMEJ, lange skabelon HR og SSA-plasmider kan også fordøjes med HindIII, som vil producere komplementære sammenhængende ender.
Vi leverer protokoller til generering af reporter-assaysubstraterne og beskriver, hvordan analyserne kan udføres, og giver detaljer om, hvordan de kan bruges til at kvantificere DSBR, herunder titrerbare responser på små molekyler, vurdering af cellulær styrke, aktivitet på mål og pathway-selektivitet.
Her har vi beskrevet protokoller til generering og implementering af en række ekstrakromosomale luminescensbaserede reportere til måling af den cellulære færdighed af de fire store DSBR-veje (HR, NHEJ, MMEJ og SSA)7. Reportersubstrater kan introduceres i celler ved forbigående transfektion og bruges til at vurdere DSBR-aktivitet ved hjælp af en følsom og robust pladebaseret udlæsning af NanoLuc-luminescens, som rekonstitueres ved engagement med beslægtede cellulære DSBR-veje.
Flere stadier af generering af reportersubstrat, transfektion af substraterne til celler og datafortolkning er afgørende for en vellykket udførelse af disse analyser. Selvom standard molekylærbiologiske teknikker bruges til at generere reportersubstraterne, sikrer visualisering af processen ved gelelektroforese den højeste kvalitet og renhed af substraterne før transfektion. Da disse assays er afhængige af transient transfektion, gælder almindelige overvejelser for disse metoder. Disse omfatter optimering af såtæthed, transfektionsbetingelser (inklusive reagenser og DNA-mængder) og vurdering af egnethed i fremadgående og omvendte transfektionsformater. Disse reporteranalyser er blevet udført med succes med en række elektroporations- og lipofektionsprotokoller, og mulighederne bør undersøges fuldt ud, før disse analyser udføres. Der skal også udvises omhu for at inspicere komponentens NanoLuc- og Firefly-signaler i stedet for blot det sammensatte reparationssignal, der udledes ved at normalisere NanoLuc-signalet (reportersubstrat) til Firefly-signalet (kontrol). Artefakter kan opstå ved, at forholdet drives af ændringer i Firefly-signalet. For eksempel bør vurdering af hæmning i dosis-respons-tilstand ved hjælp af en meget specifik forbindelse undertrykke NanoLuc-signalet på en titrerbar måde uden at forstyrre Firefly-signalet, som bør forblive stabilt (figur 4G,H). I tilfælde, hvor Firefly-signaler forstyrres, kan nyttige virkninger på reparationen dog stadig bestemmes ved at identificere et dosisvindue, hvor Firefly-signalet er upåvirket (figur 5).
Sammenlignet med de mest anvendte DSBR-reporterassays har disse ekstrakromosomale luminescensbaserede reporterassays nogle klare fordele. Da DSBR-veje er meget bevarede, selvom cellulært maskineri varierer mellem cellemodeller, kan analyserne stadig rapportere om DSBR-færdigheder og vejvalg. Dette åbner op for vurderingen af DSBR for enhver model af interesse for brugeren, så længe optimale transiente transfektionsbetingelser er fastlagt på forhånd.
Brugen af Nanoluciferase som reportergen giver også fordele i forhold til fluorescerende muligheder, som traditionelt er blevet brugt i DSBR-reporteranalyser. NanoLuc modnes hurtigt, og luminescens detekteres med høj følsomhed ved hjælp af en pladelæser8. Koblet til hastigheden af substratreparation (da reportersubstraterne transfekteres til celler med DSB-ender, der er klar til reparation), er dette format af DSBR-reporteranalyse ideelt til den hurtige ekspedition og kvantitative robusthed, der kræves til screening af små molekyler som en del af en industriel lægemiddelopdagelseskaskade. Faktisk har vi for nylig beskrevet implementeringen af det resektionsuafhængige MMEJ-reporterassay i opdagelseskaskaden, der blev brugt til identifikation af små molekylehæmmere af Polθ-polymerasedomænet13.
Der er også fleksibilitet i implementeringen af reporteranalyserne for at behandle specifikke spørgsmål om genetiske og farmakologiske forstyrrelser af DSBR (figur 3). For eksempel kan celler før transfektion af reportersubstraterne transfekteres med siRNA mod et gen af interesse i 48-72 timer. Alternativt kan virkningerne af genoverekspression på DSBR-veje testes ved at udføre plasmidtransfektion 24-48 timer før transfektion af reportersubstrater. For farmakologiske undersøgelser beskriver denne protokol allerede, hvordan brugen af små molekyler kan inkorporeres i standardarbejdsgangen, men alternative formater kan omfatte ændringer i behandlingsregimer, såsom præ-inkubationer eller udvaskninger.
Skalerbarheden af transient transfektion kan også understøtte screeningstilgange i stor skala, hvor batchtransfektion af reportersubstrater udføres før screening. Desuden kan varigheden af analysen fra transfektion til udlæsning også varieres. Selvom standardvarigheden kan være 16-24 timer, kan nogle analyser læses op på så lidt som 6 timer7. Bekymringer over toksicitet fra små molekyler eller siRNA, der kan kompromittere cellernes levedygtighed, bør også overvejes ved bestemmelse af analysevarigheden.
Sammenfattende giver de analyser, der er skitseret i denne undersøgelse og fuldt beskrevet i en nylig publikation7 , en hurtig og robust vurdering af cellulær DSBR-færdighed. De er meget følsomme og titrable, hvilket gør dem modtagelige for både genetiske og farmakologiske undersøgelser. Det er afgørende, at da reportersubstraterne kan introduceres i celler ved forbigående transfektion, har de potentialet til at blive brugt i enhver transfekterbar cellemodel af interesse, snarere end at være begrænset til specifikke cellelinjer ved stabil integration, som det er tilfældet med kromosomale DSBR-reportere. En klar begrænsning ved disse reporter-ekstrakromosomale assays er imidlertid, at manglen på integration i genomet måske ikke fuldt ud rekapitulerer den fysiologiske, kromatinerede kontekst for DNA-reparation og dens tilhørende regulatoriske signaler og orkestrering15. Til dette formål er ekstrakromosomale reporteranalyser komplementære til eksisterende metoder til DSBR-vurdering og udvider værktøjskassen af ressourcer, der er egnede til både grundforskning og lægemiddelopdagelse.
The authors have nothing to disclose.
Alt arbejde blev finansieret af Artios Pharma Ltd. Figur 1 og figur 3 blev skabt med Biorender.com.
10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |