Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.
La quiescence cellulaire est un état d’arrêt de la croissance ou de prolifération ralentie qui est décrit dans les cellules souches normales et cancéreuses (CSC). La quiescence peut protéger les CSC contre les agents chimiothérapeutiques antiprolifératifs. Dans les modèles murins de xénogreffe dérivée de patients (PDX) de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T (T-LLA), les cellules quiescentes sont associées à la résistance au traitement et à la souche. Les colorants de prolifération cellulaire sont des outils populaires pour le suivi de la division cellulaire. Le colorant fluorescent est ancré de manière covalente dans des groupes d’amines sur la membrane et des macromolécules à l’intérieur de la cellule. Cela permet de suivre les cellules marquées jusqu’à 10 divisions, qui peuvent être résolues par cytométrie en flux.
En fin de compte, les cellules ayant les taux de prolifération les plus élevés auront une faible rétention de colorant, car il sera dilué à chaque division cellulaire, tandis que les cellules dormantes à division plus lente auront la rétention la plus élevée. L’utilisation de colorants de prolifération cellulaire pour isoler les cellules dormantes a été optimisée et décrite dans des modèles murins T-LAL. En complément des modèles murins existants, le modèle T-ALL dérivé du poisson-zèbre rag2 :Myc offre un excellent moyen d’interroger l’auto-renouvellement dans la T-ALL en raison de la fréquence élevée des cellules souches leucémiques (LSC) et de la commodité du poisson-zèbre pour les expériences de transplantation à grande échelle.
Ici, nous décrivons le flux de travail pour la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec un colorant de prolifération cellulaire, l’optimisation de la concentration du colorant pour les cellules de poisson-zèbre, le passage des cellules colorées avec succès in vivo et la collecte de cellules avec différents niveaux de rétention de colorant par tri de cellules vivantes d’animaux transplantés. Étant donné l’absence de fabricants de surface cellulaire bien établis pour les LSC dans la T-ALL, cette approche fournit un moyen fonctionnel d’interroger les cellules quiescentes in vivo. Pour des résultats représentatifs, nous décrivons l’efficacité de la greffe et la fréquence LSC des cellules à haute et basse rétention de colorant. Cette méthode peut aider à étudier d’autres propriétés des cellules quiescentes, notamment la réponse aux médicaments, les profils transcriptionnels et la morphologie.
Les cellules souches adultes sont responsables de la régénération des types de cellules différenciées dans un organe donné et sont principalement présentes dansun état dormant et non divisé1,2. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui maintiennent le sang, restent en grande partie quiescentes, et seule une petite fraction entre dans le cycle cellulaire pour s’auto-renouveler ou se différencier afin de générer des composants sanguins matures3. De même, dans les cancers, une sous-population rare de cellules appelées cellules souches cancéreuses (CSC) possède la capacité de s’auto-renouveler et est responsable du maintien à long terme de la malignité4. Les cellules souches cancéreuses existent in vivo dans un état de quiescence ou de croissance lente, ce qui peut leur permettre d’échapper aux traitements anti-prolifératifs contre le cancer5, d’échapper à l’élimination par le système immunitaire6, de réduire le stress oxydatif et d’améliorer leurs voies de réparation de l’ADN7. Même un petit nombre de CSC laissés après le traitement peut potentiellement repeupler la tumeur, entraînant une rechute du patient8. Par conséquent, la compréhension de la quiescence cellulaire est très prometteuse pour l’identification des vulnérabilités potentielles des CSC et le développement de nouvelles façons de les cibler.
Les colorants de prolifération cellulaire, tels que la coloration à l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) et ses dérivés, sont couramment utilisés pour suivre la fréquence des divisions cellulaires9. Le colorant s’infiltre à travers la membrane cellulaire et, une fois à l’intérieur de la cellule, subit une activation par des estérases intracellulaires en un produit fluorescent. Le composé fluorescent résultant est retenu à l’intérieur de la cellule par les liaisons amide covalentes formées entre la fraction succinimidyle et les groupes fonctionnels amines des protéines intracellulaires10. À chaque division cellulaire, le composé fluorescent est divisé également entre les deux cellules résultantes, provoquant une double dilution du signal. Ce colorant permet de détecter jusqu’à 10 divisions cellulaires grâce à l’analyse par cytométrie en flux11.
Cette approche a déjà été utilisée pour enrichir les populations de CSC in vitro en identifiant les populations de cellules à cycle lent avec une rétention élevée du colorant11,12. Dans la LAL-T, le CFSE a été utilisé pour suivre la croissance tumorale in vivo dans des xénogreffes dérivées de patients chez la souris. Après le marquage cellulaire et trois semaines après la greffe, l’analyse par cytométrie en flux a montré une population rare de cellules qui conservaient encore la fluorescence CFSE. Cette population était associée à la souche, à la résistance au traitement et à une grande similitude avec les cellules responsables de la rechute chez les patients13. En conséquence, ce colorant fournit un outil utile pour l’étude des phénotypes des cellules souches leucémiques (LSC) dans la LAL-T.
L’objectif du travail est d’étendre l’application du colorant de prolifération cellulaire à l’étude de la quiescence in vivo à l’aide d’un modèle T-ALL de poisson-zèbre. En particulier, le modèleT-ALL 14 du poisson-zèbre piloté par rag2 :Myc offre un excellent lieu pour l’étude de l’auto-renouvellement en raison de la fréquence élevée des LSC par rapport aux modèles murins et aux maladies humaines15. De plus, l’utilisation du poisson-zèbre permet des études de transplantation à grande échelle, qui peuvent être effectuées à un coût de soins et d’entretien beaucoup plus faible que leurs homologues souris16. Les poissons-zèbres sont également excellents pour les applications d’imagerie en direct, car les cellules tumorales marquées par fluorescence peuvent être facilement visualisées à l’aide d’un simple microscope à fluorescence pour estimer le taux de développement tumoral16.
Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail pour la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec un colorant de prolifération cellulaire, suivie de la propagation in vivo des cellules colorées chez le poisson-zèbre syngénique CG1. Lors de l’apparition d’une leucémie, nous décrivons le tri des cellules qui ont conservé le colorant et leur utilisation pour une expérience ultérieure de transplantation à dilution limite afin de quantifier les taux d’auto-renouvellement des LSC. Ce protocole peut être étendu à d’autres applications, y compris le criblage in vivo de composés potentiels pour le ciblage des LSC quiescents. De plus, les cellules collectées peuvent être utilisées pour différentes analyses en aval, telles que le profilage transcriptomique, la protéomique et la métabolomique, offrant des informations uniques sur le comportement des LSC quiescentes dans la T-ALL.
Les CSL sont connues pour être résistantes aux traitements de chimiothérapie anti-prolifératifs conventionnels, et la découverte de thérapies ciblées contre ces cellules est très prometteuse pour réduire l’occurrence des rechutes et améliorer le pronostic des patients20. Des recherches antérieures ont décrit l’utilisation de colorants fluorescents de prolifération cellulaire pour identifier une petite population de cellules quiescentes associées …
The authors have nothing to disclose.
Le financement de cette recherche a été fourni par le National Cancer Institute (R37CA227656 à JSB). Cette recherche a également été financée par les ressources partagées en cytométrie en flux et en surveillance immunitaire du Markey Cancer Center (P30CA177558) de l’Université du Kentucky.
26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |