זיהוי תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T של דג זברה באמצעות צביעת התפשטות תאים
Summary
השתמשנו בצביעת התפשטות תאים כדי לזהות תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה מסוג T של דג הזברה. הכתם נשמר בתאים שאינם מתחלקים ומצטמצם במהלך התפשטות התאים, מה שמאפשר בחירה של תאים רדומים להמשך חקירה. פרוטוקול זה מספק כלי פונקציונלי לחקר התחדשות עצמית בהקשר של שקט תאי.
Abstract
שקט תאי הוא מצב של עצירת גדילה או התפשטות איטית המתואר בתאי גזע נורמליים וסרטניים (CSC). שקט עשוי להגן על CSCs מפני תרופות כימותרפיות נוגדות שגשוג. במודלים של עכברי מסוג T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) שמקורם בחולה xenograft (PDX), תאים שקטים קשורים לעמידות לטיפול ולגזע. צבעי התפשטות תאים הם כלים פופולריים למעקב אחר חלוקת התא. הצבע הפלואורסצנטי מעוגן באופן קוולנטי לקבוצות אמין על הממברנה ומקרומולקולות בתוך התא. זה מאפשר מעקב אחר תאים מסומנים עבור עד 10 חלוקות, אשר ניתן לפתור על ידי ציטומטריית זרימה.
בסופו של דבר, תאים עם שיעורי ההתרבות הגבוהים ביותר יהיו בעלי שימור צבע נמוך, מכיוון שהוא ידולל עם כל חלוקת תא, בעוד שתאים רדומים המתחלקים לאט יותר יהיו בעלי השימור הגבוה ביותר. השימוש בצבעי התרבות תאים כדי לבודד תאים רדומים עבר אופטימיזציה ותואר במודלים של עכברי T-ALL. מודל T-ALL של דג הזברה שמקורו ב-rag2:Myc, המשלים את דגמי העכברים הקיימים, מספק מקום מצוין לחקור התחדשות עצמית ב-T-ALL בשל התדירות הגבוהה של תאי גזע לוקמיים (LSCs) והנוחות של דגי זברה לניסויי השתלה בקנה מידה גדול.
במאמר זה אנו מתארים את תהליך העבודה לצביעה של תאי T-ALL של דגי זברה באמצעות צבע להתרבות תאים, אופטימיזציה של ריכוז הצבע עבור תאי דגי זברה, העברת תאים מוכתמים בהצלחה in vivo, ואיסוף תאים עם רמות שונות של שימור צבע על ידי מיון תאים חיים מבעלי חיים מושתלים. בהתחשב בהיעדרם של יצרני משטחי תאים מבוססים היטב עבור LSCs ב- T-ALL, גישה זו מספקת אמצעי פונקציונלי לחקור תאים שקטים in vivo. לקבלת תוצאות מייצגות, אנו מתארים את יעילות הקליטה ואת תדר LSC של תאים שומרי צבע גבוהים ונמוכים. שיטה זו יכולה לסייע בחקירת תכונות נוספות של תאים שקטים, כולל תגובה לתרופות, פרופילי שעתוק ומורפולוגיה.
Introduction
תאי גזע בוגרים אחראים להתחדשות של סוגי תאים ממוינים באיבר נתון והם נמצאים בעיקר במצב רדום, לא מתחלק 1,2. לדוגמה, תאי גזע המטופויטיים (HSCs), אשר שומרים על הדם, נשארים במידה רבה שקטים, ורק חלק קטן נכנס למחזור התא כדי לחדש את עצמם או להתמיין כדי לייצר מרכיבי דם בוגרים3. באופן דומה, בסרטן, תת-אוכלוסייה נדירה של תאים הנקראת תאי גזע סרטניים (CSC) היא בעלת יכולת התחדשות עצמית ואחראית לתחזוקה ארוכת טווח של הממאירות4. תאי גזע סרטניים קיימים in vivo במצב של שקט או צמיחה איטית, מה שעשוי לאפשר להם להימלט מטיפולים אנטי-שגשוגייםלסרטן 5, להתחמק מפינוי על ידי מערכת החיסון6, להפחית את העקה החמצונית ולשפר את מסלולי תיקון הדנ”א שלהם7. אפילו מספר נמוך של CSCs שנותרו מאחור לאחר הטיפול יכול פוטנציאלית לאכלס מחדש את הגידול, וכתוצאה מכך הישנות של המטופל8. בהתאם לכך, הבנת השקט התאי טומנת בחובה הבטחה גדולה לזיהוי נקודות תורפה פוטנציאליות של CSCs ופיתוח דרכים חדשות להתמקד בהם.
צבעי התפשטות תאים, כגון כתם carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ונגזרותיו, משמשים בדרך כלל למעקב אחר תדירות חלוקות התא9. הצבע חודר לרוחב קרום התא, וברגע שהוא נכנס לתא, הוא עובר הפעלה על ידי אסטרזות תוך-תאיות למוצר פלואורסצנטי. התרכובת הפלואורסצנטית המתקבלת נשמרת בתוך התא באמצעות קשרי האמיד הקוולנטיים הנוצרים בין succinimidyl moiety לבין קבוצות תפקודיות אמין של חלבונים תוך תאיים10. עם כל חלוקה תאית, התרכובת הפלואורסצנטית מחולקת באופן שווה בין שני התאים המתקבלים, מה שגורם לדילול אות כפול. צבע זה מאפשר זיהוי של עד 10 חלוקות תאים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה11.
גישה זו שימשה בעבר להעשרת אוכלוסיות CSC במבחנה על ידי זיהוי אוכלוסיות מחזור איטי של תאים עם שימור גבוה של צבע11,12. ב- T-ALL, CFSE שימש למעקב אחר צמיחת הגידול in vivo ב- xenografts שמקורם בחולים בעכברים. לאחר תיוג תאים ושלושה שבועות של השתלה, ניתוח ציטומטריית זרימה הראה אוכלוסייה נדירה של תאים שעדיין שמרו על פלואורסצנטיות CFSE. אוכלוסייה זו נמצאה קשורה לגבעול, עמידות לטיפול ודמיון גבוה לתאים הגורמים להישנות בחולים13. בהתאם לכך, צבע זה מספק כלי שימושי לחקר פנוטיפים של תאי גזע לוקמיה (LSC) ב- T-ALL.
מטרת העבודה היא להרחיב את היישום של צבע התפשטות התאים כדי לחקור שקט in vivo באמצעות מודל T-ALL של דג זברה. בפרט, דג הזברה מונע rag2:Myc T-ALL מודל14 מספק מקום מצוין לחקר התחדשות עצמית בשל התדירות הגבוהה של LSCs בהשוואה למודלים עכברים ומחלות אנושיות15. בנוסף, השימוש בדגי זברה מאפשר מחקרי השתלה בקנה מידה גדול, אשר יכולים להיעשות בעלות נמוכה בהרבה של טיפול ותחזוקה בהשוואה לעמיתיהם העכבר16. דגי זברה מצוינים גם ליישומי הדמיה חיים, שכן ניתן לצפות בקלות בתאי גידול המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט כדי להעריך את קצב התפתחות הגידול16.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את תהליך העבודה להכתמת תאי T-ALL של דגי זברה עם צבע התפשטות תאים ולאחר מכן התפשטות in vivo של תאים מוכתמים בדגי זברה CG1 סינגניים. עם התפתחות לוקמיה, אנו מתארים את מיון התאים ששמרו על הצבע ואת השימוש בהם לניסוי השתלת דילול מגביל לאחר מכן כדי לכמת את שיעורי ההתחדשות העצמית של LSC. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עבור יישומים נוספים, כולל סינון תרופות in vivo של תרכובות פוטנציאליות עבור מיקוד של LSCs שקט. בנוסף, תאים שנאספו יכולים לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם, כגון פרופיל שעתוק, פרוטאומיקה ומטבולומיקה, ומציעים תובנות ייחודיות על ההתנהגות של LSCs שקטים ב- T-ALL.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSCs ידועים כעמידים לטיפולים כימותרפיים קונבנציונליים ואנטי-שגשוגיים, ומציאת טיפולים ממוקדים נגד תאים אלה טומנת בחובה הבטחה גדולה בהפחתת התרחשות הישנות ושיפור פרוגנוזה20 של המטופל. מחקר קודם תיאר את השימוש בכתמי התפשטות תאים פלואורסצנטיים כדי לזהות אוכלוסי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון למחקר זה ניתן על ידי המכון הלאומי לסרטן (R37CA227656 ל-JSB). מחקר זה נתמך גם על ידי Flow Cytometry and Immune Monitoring Shared Resources of the University of Kentucky Markey Cancer Center (P30CA177558).
Materials
| 26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
| 35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
| 40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
| 96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
| Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
| CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
| Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
| Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
| Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
| Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
| MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
| Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
| Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118 (2), 149-161 (2004).
- Li, L., Bhatia, R. Stem cell quiescence. Clin. Cancer Res. 17 (15), 4936-4941 (2011).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Chen, W., Dong, J., Haiech, J., Kilhoffer, M. -. C., Zeniou, M. Cancer stem cell quiescence and plasticity as major challenges in cancer therapy. Stem Cells Int. 2016, 1740936 (2016).
- Kleffel, S., Schatton, T. Tumor dormancy and cancer stem cells: Two sides of the same coin. Adv Exp Med Biol. 734, 145-179 (2013).
- Tuy, K., Rickenbacker, L., Hjelmeland, A. B. Reactive oxygen species produced by altered tumor metabolism impacts cancer stem cell maintenance. Redox Biol. 44, 101953 (2021).
- Zhou, B. -. B. S., et al. Tumour-initiating cells: Challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 806-823 (2009).
- Lyons, A. B., Blake, S. J., Doherty, K. V. Flow cytometric analysis of cell division by dilution of cfse and related dyes. Curr Protoc Cytom. 64 (1), 11-12 (2013).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of cfse dye dilution. J Immunol Methods. 243 (1-2), 147-154 (2000).
- Azari, H., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse) to identify quiescent glioblastoma stem-like cells. Methods Mol Biol. 1686, 59-67 (2018).
- Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse). J Vis Exp. (62), e3918 (2012).
- Ebinger, S., et al. Characterization of rare, dormant, and therapy-resistant cells in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 30 (6), 849-862 (2016).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced t cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation. Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. (53), e2790 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).
- Hu, Y., Smyth, G. K. Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Bhojwani, D., Pui, C. -. H. Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
- Al-Hamaly, M. A., et al. Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia. Biomed Pharmacother. 170, 116013 (2024).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
