Summary

로타리 문신 기계로 Xenopus laevis 를 문신하는 방법

Published: June 28, 2024
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Summary

여기에서는 회전식 문신 기계로 성인 Xenopus laevis (아프리카 발톱 개구리)에 문신을 새기는 방법을 설명합니다. 적절한 문신을 하면 몇 달 동안 지속되는 어둡고 쉽게 읽을 수 있는 숫자가 생성되며 연구 및 기록 보관 목적으로 동물을 쉽게 구별할 수 있습니다.

Abstract

동물 모델은 생물 의학 연구의 범위를 확장하여 발달, 분자 및 세포 생물학에 대한 이해를 높이고 연구원이 인간 질병을 모델링할 수 있도록 합니다. 개별 동물을 기록하고 추적함으로써 연구자들은 연구에 필요한 동물의 수를 줄이고 동물 복지를 개선하기 위한 관행을 개선할 수 있습니다. 포유류를 표시하고 추적하기 위한 몇 가지 잘 문서화된 방법이 존재하며, 여기에는 귀 펀칭 및 귀 태그가 포함됩니다. 그러나 수생 양서류 종을 표시하는 방법은 제한적이며, 기존 자원은 구식이거나 비효율적이거나 엄청나게 비용이 많이 듭니다. 이 원고에서는 회전식 문신 기계로 Xenopus laevis 를 표시하는 방법과 모범 사례를 간략하게 설명합니다. 적절한 문신은 고품질 문신을 만들어 연구자들이 개인을 쉽게 구별할 수 있도록 하고 동물의 건강에 대한 위험을 최소화합니다. 우리는 또한 문신이 빨리 퇴색하고 동물에게 불필요한 해를 끼칠 수 있는 품질이 좋지 않은 문신의 원인을 강조합니다. 이 접근 방식을 통해 연구자와 수의사는 양서류를 표시하여 생물학적 복제 및 유전자 변형 계통을 추적하고 동물의 건강 상태에 대한 정확한 기록을 유지할 수 있습니다.

Introduction

동물 모델은 인간의 건강과 관련된 질문을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 실제로, 동물 모델을 사용한 생물 의학 연구는 건강한 동물 군집의 신중한 조직과 유지를 필요로 합니다. 윤리적 동물 취급 및 축산을 위한 모범 사례는 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동물 복지를 보장하기 위한 관행을 개선하는 것을 목표로 합니다1. Xenopus laevis(X. laevis; 아프리카 발톱 개구리)와 Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog)는 1930년대 남아프리카 공화국 의사들이 X. laevis를 사용하여 최초의 임신 테스트를 실시한 이래로 생물의학 연구에 사용되어 왔다2. 현대의 임신 테스트기는 더 이상 개구리를 필요로 하지 않지만, 제노푸스 연구의 역할은 여전히 유효하다. 생물 의학 연구에 Xenopus를 사용하는 장점으로는 주석이 잘 달린 게놈3, 큰 난자의 연중 유도 배란4, 체외 수정이 가능한 외부에서 낳은 난자 등이 있습니다. 이러한 특징은 척추 동물의 발생학 및 발달 (vertebrate embryology)과 발달 (er)5,6,7, 기초 분자 및 세포 생물학 (basic molecular and cellular biology) 7,8,9,10 및 인간 질병 모델링 (human disease) 7,11,12,13에 유용한 자산입니다.

개별 Xenopus 동물을 추적하기 위한 신뢰할 수 있는 방법은 생물학적 복제를 기록하고 연구의 엄격성과 재현성을 개선하는 데 필수적입니다. Xenopus 는 종종 그룹으로 수용되기 때문에 동물 표시를 통해 연구자는 개별 동물을 쉽게 추적 할 수 있습니다4. 동물에 대한 정확한 기록을 유지하면 시간과 자원을 절약하고 동물의 건강을 추적하는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 동물의 개별 식별은 형질전환 Xenopus 라인을 생성하기 위한 조직 워크플로우를 개선할 수 있는데, 이는 시퀀싱14에 의해 검증된 특정 유전자형을 가진 여러 세대의 개구리가 필요하기 때문에 동물의 조직 및 개별 식별이 필요하기 때문입니다. 이러한 돌연변이가 쉽게 식별할 수 있는 성인 표현형이 없는 경우 특히 그렇습니다. 마찬가지로, Xenopus 난모세포와 배아를 사용하여 기본 세포 및 발달 생물학을 연구하면 개별 동물을 추적할 수 있습니다. 배란을 유도한 후 동물은 과배란 증후군과 같은 건강 합병증을 예방하기 위해 최소 3개월 동안 휴식을 취해야 합니다15. 개체 식별 방법은 동물이 너무 자주 배란하도록 유도되지 않도록 합니다.

또한 동물을 표시하고 추적하면 실험실 직원이 동물의 건강 문제를 추적할 수 있습니다. 동일한 유전자형의 동물이 병에 걸렸다는 것은 과도한 근친 교배 또는 전이 유전자와 관련된 예상치 못한 건강 문제를 나타낼 수 있습니다. 마찬가지로, 최근 배란 후 병에 걸린 동물은 시약, 재료 또는 기술에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다. 동물과 동물의 건강을 추적하면 실험실 직원과 수의사가 우려 사항이 다시 떠오를 때 후속 조치를 취하고 향후 질병을 예방하기 위한 예방 조치를 취할 수 있습니다. 포유류에는 수많은 식별 방법이 있습니다. 마우스에 대한 영구적인 방법에는 귀 펀칭, 귀 태그, 문신 및 피하 마이크로칩이 포함됩니다16. 이들은 식민지 또는 케이지 내의 동물을 명확하고 신뢰할 수 있게 구별할 수 있으며 실험실 직원이 쉽게 투여할 수 있습니다. 귀 펀칭과 같은 방법은 최소 침습적이며 한 가지 특수 장비만 필요하며 대부분의 연령의 동물에게 효과가 있습니다. 이러한 시스템은 생쥐에게는 간단하고 유용하지만 개구리에서 사용하는 것은 고유한 일련의 문제를 제시합니다. 개구리와 다른 양서류는 귓바퀴(pinna, 외귀 구조)가 없습니다. 일부 연구자들은 동물의 턱, 발가락 또는 뒷다리에 태그를 부착했습니다17,18. 이 접근법은 다양한 문제를 낳았다: 턱 꼬리표는 자극을 일으켰고, 흥분한 개구리는 앞다리로 꼬리표를 떼어내려고 시도했다17. 발가락 태그는 발가락 사이의 물갈퀴를 뚫어 움직임을 방해하고 길을 잃을 위험이 있습니다. 따라서 양서류는 식별을 위해 자체 방법이 필요합니다. 역사적으로, 발가락 깎기는 또한 양서류17,19를 표시하는 데 사용되었습니다. 발가락은 날카로운 가위로 잘리며, 앞발과 뒷발의 발가락 길이 또는 발가락이 뒤로 자란 각도 (도롱뇽의 경우)로 동물을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 발가락 깎기가 동물의 움직임을 손상시킬 수 있다는 윤리적 우려를 제기한다17. 또한 출혈을 일으키고 감염의 위험을 초래할 수 있습니다. 또 다른 확립된 마킹 시스템은 피부 자가이식술로, 개구리의 한 부분에서 피부를 채취하여 다른 부분에 외과적으로 부착합니다. 예를 들어, 개구리의 가슴 부분으로부터 밝은 색의 피부 이식편을 사용하여 개구리의 등이나 어깨를 표시하는 방법이 설명되어있다(20). 피부 이식은 또한 한계와 위험을 수반합니다 : 절차는 침습적이며 잠재적으로 치명적인 질병 인 Aeromonas hydrophila 감염 또는 붉은 다리의 위험을 초래합니다. 자가이식편의 완전한 치유는 최대 6주가 소요됩니다. 그리고 설명된 방법을 사용하면 자가이식편을 넣을 장소가 제한되어 있기 때문에 6마리의 개구리만 함께 수용할 수 있습니다20.

덜 침습적인 마킹 접근법은 유리 비드 및 트랜스폰더 칩(17,19)을 포함한다. 유리구슬 공법에서는 유리구슬을 작은 봉합사에 끼워 개구리의 피부에 꿰매는 방식입니다. 이것은 피부 자가이식편보다 더 큰 다양성을 제공하며 최소 60개의 독특한 색상 조합을 제공합니다. 그러나 봉합사가 빠져 나와 구슬이 손실될 위험이 있습니다. 대안적으로, 마이크로칩 트랜스폰더를 개구리의 등쪽 림프낭의 피부 아래에 이식할 수 있습니다. 이것은 가장 영구적인 마킹 방법으로 간주되며 잠재적으로 무한한 수의 동물을 개별적으로 식별하고 분류할 수 있습니다. 그러나 이것은 개별 마이크로칩이 비싸고 큰 콜로니를 표시하는 데 비용이 많이 들기 때문에 가장 비용이 많이 드는 방법이기도 합니다. 마이크로칩은 또한19를 판독하기 위해 특수 스캐너를 필요로 한다. Xenopus 식별을 위한 일반적인 접근 방식 중 하나는 동물의 자연스러운 색상과 패턴을 참조하는 것입니다. 이것은 X. laevis와 같은 개구리에게 특히 효과적인데, 이들은 성체가 될 때까지 뚜렷한 패턴을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 패턴은 스트레스에 따라 시간이 지남에 따라 변할 수 있으며, 개구리가 투명한 용기와 착색된 용기 사이를 이동할 때 색상이 다르게 나타날 수 있다15. 또한, 이 식별 방법은 X. laevis에 비해 뚜렷한 표시 패턴이 적은 X. tropicalis나 색상 표시가 없는 알비노 동물에 대해서는 덜 유용하다21. 뚜렷한 표시가 있는 종의 경우에도 실험실 직원이 표시의 배치와 크기를 다르게 해석할 수 있으며, 이로 인해 식별에 오류가 발생할 수 있습니다. 이 때문에 동물을 촬영하는 것은 추가 식별 방법과 함께 가장 신뢰할 수 있습니다. 따라서 우리는 쉽게 식별할 수 있고 영구적이며 최소한으로 침습적인 기술을 사용하여 Xenopus 동물을 표시하고 식별하려고 합니다.

양서류에 문신을 새기는 방법을 설명하는 출판 된 자료는 제한되어 있습니다. 문신은 히트 브랜드, 질산은 브랜드 및 동결 브랜드를 포함한 다른 브랜딩 기술과 함께 설명되었습니다17. 같은 자료에서 타투는 27G 피하 주사 바늘로 숫자를 그리는 방식으로 이루어졌으며, 숫자 또는 다른 표시로 된 철사를 사용하는 다른 브랜딩 기술과 달리 감염을 일으키지 않는 과정에 주목했습니다. 또 다른 출처에서는 전기 문신 기계 (진동 바늘로 묘사 됨)가 개구리를 표시하는 데 사용되었지만 기술에 대한 세부 사항은 거의 제공되지 않았습니다17,19. 저자들은 이 시술이 개구리의 보호막인 점액층을 방해함으로써 붉은다리의 위험을 증가시킨다고 경고한다. 완전히 비침습적(예: 사진)이고 영구적(예: 마이크로칩)인 표시 또는 식별 방법은 없지만 문신은 효과적인 절충안을 제공합니다. 문신은 피부 자가 이식과 같은 다른 기술에 비해 비교적 간단합니다. 추가 이점으로는 학습 곡선이 작고 상대적으로 저렴한 장비가 있습니다. 수생 양서류에 문신을 새기는 것은 연구자를 위협하고 성공적인 동물 표시를 손상시킬 수 있는 특정 도전 과제가 있습니다. 이 논문은 연구자들에게 회전식 문신 기계로 성인 Xenopus에게 문신을 새기는 잘 문서화 된 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

Protocol

설명된 모든 동물 시술은 다트머스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 1. 장비 설정 참고: 절차에 대한 작업 흐름과 벤치 설정 예가 포함되어 있습니다(그림 1). 타투 건과 풋 페달을 전원 공급 장치에 연결합니다. 발 페달을 작업 표면 아래에 놓습니다.</…

Representative Results

고품질 문신은 개구리의 가슴에 어둡고 읽을 수 있는 획이 있으며 몇 피트 떨어진 곳에서도 명확하게 구별할 수 있습니다(그림 5A). 일반적으로 숫자와 표시가 클수록 가독성이 좋지만 긴 이름과 숫자는 개구리의 가슴에 편안하게 맞도록 작게 만들 수 있습니다. 문신 수명은 판단하기가 더 어렵지만 고품질 개구리 문신은 최소 3-6개월 동안 어둡고 읽을 수 있어야 합니다(<stron…

Discussion

인간에게 문신을 새기는 것은 수천 년 전으로 거슬러 올라가는 예술 형식이며, 인간이 문신을 하는 동안 동물에게도 문신을 하거나 낙인을 찍었습니다23. 동물, 특히 포유류를 표시하는 장비와 기술은 잘 확립되어 있고 잘 문서화되어 있으며 널리 접근할 수 있습니다. 동물에 표시를 하는 것은 원래 가축과 절도 방지를 구별하기 위한 것이었지만23 생물의학 연?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 다트머스 대학의 비교 의학 및 연구 센터(Center for Comparative Medicine and Research)가 이 프로토콜에 사용된 동물을 위해 매일 사육을 제공한 것에 대해 감사드립니다. 또한 프로토콜을 테스트하고 동물 사진을 촬영하는 데 도움을 준 Leah Jacob과 Adwaita Bose에게도 감사드립니다. 마지막으로, 타투 실습에 대한 교육을 제공한 Ann Miller의 연구실에 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 R00 GM147826 J.L.의 지원을 받았습니다.

Materials

3 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1203RLB Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA Worldwide Tattoo Supply HTIPRS5-U Packaged sterile
5 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1205RLB Packaged sterile
7 needle round liners Worldwide Tattoo Supply 1207RLB Packaged sterile
Clip Cord Worldwide Tattoo Supply N/A
Foot pedal Worldwide Tattoo Supply N/A
Inkpots Worldwide Tattoo Supply N/A
Kimwipes, delicate task wipes Fisher Scientific 06-666A
RCA Connection Worldwide Tattoo Supply N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz Worldwide Tattoo Supply SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Stainless steel grips Worldwide Tattoo Supply N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Worldwide Tattoo Supply N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set Worldwide Tattoo Supply STEALTH2-SET
Styrofoam island N/A N/A This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate) Sigma-Aldrich E10521 CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels Grainger 2U229 Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply Worldwide Tattoo Supply N/A
Wash bottle (with frog-safe water) Fisher Scientific FB0340923T Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female Xenopus1 N/A
Zip-top plastic bag N/A N/A This bag should be large enough to hold the styrofoam island

References

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Cite This Article
Suber, J. R., Landino, J. Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine. J. Vis. Exp. (208), e67086, doi:10.3791/67086 (2024).

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