JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Immunology and Infection

Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem

Published: April 25, 2025
doi:
10.3791/67542
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , , , , , , , , , , , ,
1Department of General Practice,The First Hospital of Jilin University2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases,The First Hospital of Jilin University3Bioinformatics Laboratory,The First Hospital of Jilin University

Summary

Om de snelle en nauwkeurige detectie van Acinetobacter baumannii te vergemakkelijken, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in combinatie met LbaCas12a-endonuclease voor het identificeren van A. baumannii-infecties .

Abstract

Acinetobacter baumannii, een gramnegatieve bacterie, is berucht vanwege het veroorzaken van ernstige infecties met hoge sterftecijfers. Snelle en nauwkeurige detectie van A. baumannii is cruciaal voor een snelle behandeling, effectieve infectiebeheersing en het terugdringen van antibioticaresistentie. Er is echter geen geschikte methode om A. baumannii snel en gemakkelijk ter plaatse op te sporen. Het DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)-systeem biedt een snelle, nauwkeurige en gevoelige benadering van A. baumannii-detectie door de doelwitspecifieke herkenningsmogelijkheden van Cas12a te integreren met de isotherme amplificatie-efficiëntie van Recombinase Polymerase Amplification (RPA). Dit protocol beschrijft de detectie van A. baumannii met behulp van RPA in combinatie met LbaCas12a-endonuclease. De volgende stappen worden in dit artikel beschreven: extractie van DNA, selectie van een specifieke DNA-sequentie, ontwerp van primer en CRISPR-RNA (crRNA), constructie van positief recombinant plasmide, opzet van Cas12a-RPA-assay, optimalisatie van het RPA-amplificatiesysteem, visualisatie van de RPA-CRISPR/Cas12a-assay met behulp van een fluorescentiedetectietool zoals een real-time PCR-instrument, en evaluatie van gevoeligheid en specificiteitsevaluatie.

Introduction

In de klinische microbiologie vormt het detecteren van Acinetobacter baumannii-infecties een grote uitdaging. Deze gramnegatieve bacterie kan infecties veroorzaken met ernstige klinische symptomen, zelfs bij hoge sterftecijfers, vooral bij immuungecompromitteerde patiënten1. Traditionele, op kweek gebaseerde detectiemethoden voor pathogene infecties zijn tijdrovend en kunnen niet gevoelig zijn, wat de behandeling met antibiotica kan vertragen en de resultaten voor de patiënt in gevaar kan brengen. Snelle en nauwkeurige identificatie van A. baumannii is cruciaal voor een effectieve behandeling en bestrijding van uitbraken. Moleculaire technieken die gebruik maken van nucleïnezuuramplificatie zijn onderzocht om aan deze behoefte te voldoen. Deze benaderingen vereisen echter vaak geavanceerde thermische cyclusapparatuur en kunnen worden beperkt door goed opgeleide technici en gevestigde laboratoria. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, is het onderzoek steeds meer gericht op het ontwikkelen van isotherme versterkingsmethoden 2,3,4.

Recombinase Polymerase Amplification (RPA) is een methode die is ontwikkeld door Piepenburg et al 5 en wordt gebruikt om DNA te amplificeren, vergelijkbaar met polymerasekettingreactie (PCR) maar zonder de noodzaak van temperatuurwisselingen. Deze methode omvat 50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM kaliumacetaat, 14 mM magnesiumacetaat, 2 mM DTT, 5% PEG20000 (een polyethyleenglycol met een hoog moleculair gewicht), 200 μM dNTP’s, 3 mM ATP, 50 mM fosfocreatine, 100 μg/ml creatinekinase, 120 μg/ml UvsX, 30 μg/ml UvsY, 900 μg/ml Gp32, 30 μg/ml Bsu LF, 450 nM primers en DNA-sjablonen. Het amplificatieproces begint met de binding van het recombinase-eiwit UvsX aan primers in aanwezigheid van 3 mM ATP en 5% PEG20000 de vorming van een recombinase-primercomplex. Dit complex vergemakkelijkt vervolgens de combinatie van primers met de homologe sequenties op het dubbelstrengs DNA.

Met behulp van UvsY vergemakkelijkt de recombinase UvsX de uitwisseling tussen de primer en de sjabloonstreng, wat resulteert in de verplaatsing van één streng van het doel-DNA. Gp32 helpt de enkelstrengs DNA-structuur te behouden. Ten slotte dissocieert de recombinase en bindt een DNA-polymerase (Bsu LF) die in staat is DNA-strengen te verplaatsen, aan het 3′-uiteinde van de primer, waardoor deze wordt verlengd in aanwezigheid van desoxyribonucleosidetrifosfaten (dNTP’s). Dit proces wordt cyclisch herhaald, waardoor een exponentiële versterking wordt bereikt. Alle versterkingsprocessen kunnen binnen 20-40 minuten en bij relatief constante temperaturen tussen 37 °C en 42 °C worden voltooid. Dit temperatuurbereik is ongeveer identiek aan fysiologische temperaturen, waardoor RPA in een minimalistische omgeving kan worden uitgevoerd, waardoor RPA een veelzijdig en efficiënt hulpmiddel is voor DNA-detectie en -analyse.

Het geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR) en CRISPR-geassocieerd eiwit (CRISPR-Cas) systeem functioneert als een adaptief immuunmechanisme in bacteriën en archaea, dat klasse I- en klasse II-systemen omvat. Klasse II omvat eiwitten zoals Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) en Cas14, die doel-DNA of RNA identificeren en splitsen onder leiding van CRISPR-RNA (crRNA)6,7,8. LbaCas12a (of Cpf1) is een crRNA-geleide DNA-endonuclease. Het crRNA dient als een leidend RNA binnen het CRISPR-Cas-systeem, waar het complexeert met Cas-eiwitten. Het maakt gebruik van zijn spacergebied om te paren met het doel-DNA, waardoor het eiwitcomplex effectief naar de doelsequenties wordt gestuurd. De sequentie 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ dient als de geconserveerde crRNA-herhaling, een constant element in alle LbaCas12a crRNA’s. Na deze herhaling volgt een doelwitspecifiek segment dat verschilt op basis van het beoogde DNA-doelwit. Deze targeting-sequentie varieert van 18 tot 24 nucleotiden in lengte.

De PAM-sequentie (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, waarbij V A, C of G kan zijn) bevindt zich aan het 5′-uiteinde van de niet-complementaire streng van het DNA-doelwit. De Cas12a-sneden richten zich op dubbelstrengs DNA op de PAM-sequentie. Vervolgens voeren de geactiveerde Cas-eiwitten een niet-specifieke trans-splitsing uit van enkelstrengs DNA (ssDNA)9,10,11,12. Zo ondergaat ssDNA gelabeld met een fluorofoor en quencher splitsing, wat resulteert in de uitzending van een fluorescerend signaal na collaterale splitsing 8,13. De fluorescentie-intensiteit kan worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescentielezer voor nauwkeurige detectie van nucleïnezuur14. Cas12a wordt met name op grote schaal gebruikt voor DNA-analyse, waarbij de binding en splitsing van doelsequenties afhankelijk is van de herkenning van het Protospacer-Adjacent Motif (PAM), terwijl Cas13a onafhankelijk van een dergelijke vereiste werkt.

CRISPR-Cas-systemen 15,16,17 vergemakkelijken splitsing binnen een enkele reactie 18,19,20,21. Door de bovenstaande twee te combineren, kan een robuust hulpmiddel ontstaan dat bekend staat als A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) voor nucleïnezuurdetectie 22,23,24. Dit protocol demonstreert het gebruik van RPA in combinatie met de DNase-activiteit van Cas12a om specifiek een crRNA-geleide sequentie in het 16s rDNA-gen van A. baumannii te richten en te splitsen, waardoor gevoelige en nauwkeurige detectie van de ziekteverwekker mogelijk wordt.

De A. baumannii-DETECTR-methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele detectiemethoden25,26. Ten eerste stroomlijnt de isotherme eigenschap van RPA operationele procedures en verlaagt het de kosten door middel van het thermische cycler-onafhankelijke versterkingsmechanisme5. Ten tweede verhoogt de Cas12a-endonuclease de specificiteit van de test door middel van crRNA-gemedieerde targeting en Watson-Crick-basenparing7. Ten slotte bespaart het gebruik van de één-buismethode van A. baumannii-DETECTR niet alleen tijd, maar vermindert het ook het risico op amplicon-besmetting aanzienlijk19.

Het protocol schetst stappen voor de extractie van DNA-extractie, de selectie van doel-DNA-sequenties, het ontwerp van primers en crRNA’s, de constructie van positieve recombinante plasmiden, het opzetten van de Cas12a-RPA-test, de optimalisatie van het optimaliseren van RPA-amplificatie en de visualisatie van visualisatieresultaten met behulp van fluorescentiedetectie-instrumenten zoals een Real-time PCR-machine, Compleet met gevoeligheids- en specificiteitsevaluaties.

De A. baumannii-DETECTR-methode is veelbelovend voor het verbeteren van de patiëntresultaten door het mogelijk maken van tijdige en effectieve behandeling, robuuste infectiebeheersing en het indammen van de verspreiding van antibioticaresistentie. Dit protocol kan dienen als een uitgebreide richtlijn voor de implementatie van Cas12a-RPA-technologie, waardoor het nut ervan in verschillende zorgomgevingen wordt vergroot. Het is echter van cruciaal belang op te merken dat elke stap moet worden geoptimaliseerd op basis van specifieke laboratoriumomstandigheden en de verscheidenheid aan monsters om consistente en betrouwbare resultaten te garanderen.

Protocol

1. Bouw van de A. baumannii -DETECTR

OPMERKING: De constructie van A. baumannii-DETECTR is een proces in vier stappen waarbij primer en crRNA worden ontworpen, de constructie van positieve recombinante plasmideconstructie, de bereiding van reactieoplossingen, isotherme DNA-amplificatie door RPA en de visualisatie van de RPA-CRISPR/Cas12a-assay. Het schema van de DETECTR-test wordt geïllustreerd in figuur 1.

  1. Ontwerp van primer en crRNA (zie aanvullend bestand 1)
    1. Ontwerp 12 paar primers met behulp van ontwerptools op basis van Primer-ontwerpprincipes. Verkrijg vier voorwaartse primers (F0-F3) en drie omgekeerde primers (R1-R3) om twaalf paar primers samen te stellen (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Zorg ervoor dat het 5′-uiteinde van de primer C- of T-basen bevat binnen de eerste 3-5 nucleotiden in plaats van een continue G-rek. Zorg er bovendien voor dat de laatste drie nucleotiden aan het 3′-uiteinde idealiter G- en C-basen zijn om de amplificatie te verbeteren.
      2. Ontwerp primers zonder zelfcomplementaire sequenties om haarspeldvorming te voorkomen en met niet meer dan vier complementaire of homologe basen ertussen. Blijf uit de buurt van 3′ eindcomplementariteit om dimerisatie van de primer te voorkomen.
    2. Evalueer elk primerpaar op specificiteit met behulp van de Primer-BLAST-tool van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) om de werkzaamheid en specificiteit van de primers te beoordelen.
      OPMERKING: Primer-BLAST kan de NCBI-database gebruiken om sequenties te vinden die overeenkomen met de ontworpen primers, zodat gebruikers de werkzaamheid en specificiteit van de primers kunnen beoordelen.
    3. Ontwerp na de primerscreening het CRISPR-RNA (crRNA) of gids-RNA (gRNA) met behulp van de LbaCas12a crRNA-scaffold-sequentie (5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′) als de vaste sequentie. Neem een doelspecifiek segment op (5′-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3′) en zorg ervoor dat het PAM-motief zich aan het 5′-uiteinde van de niet-complementaire streng bevindt.
      OPMERKING: De sequenties van alle oligonucleotiden en crRNA worden weergegeven in tabel 1.
  2. Positieve recombinante plasmideconstructie
    1. Amplificeer het 16s rDNA-segment met behulp van de primerset A. baumannii 16s rDNA-F (voorwaartse primer) en A. baumannii 16s rDNA-R (omgekeerde primer).
      1. Voeg 1 μL 10 μM F en 10 μM R, 10 μL 5x FastpFu Buffer, 1 μL FastpFu Polymerase, 4 μL 2,5 mM dNTP’s, 1 μL 10 ng/μL A. baumannii genomisch DNA en 32 μL nucleasevrij water toe aan het 50 μL PCR-systeem.
      2. Stel de PCR-cyclusomstandigheden als volgt in: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 33 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 55°C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut en 20 s. Voer ten slotte 10 minuten uit bij 72°C voor de laatste verlenging.
    2. Gebruik een DNA-zuiveringskit om het positieve PCR-product te zuiveren volgens de instructies van de fabrikant. Kloon vervolgens het gezuiverde DNA in de pUC57-vector, die is verteerd met BamHI- en SalI-enzymen.
      OPMERKING: Dit proces zal resulteren in de aanmaak van een positief recombinant plasmide dat een geconserveerd gebied bevat.
    3. Verdun het positieve recombinante plasmide serieel in tienvoudige stappen met gesteriliseerd ddH2O om een concentratie van één kopie/μL tot 107 kopieën/μL te bereiken. Bewaar het verdunde plasmide bij -20 °C voor volgende experimenten.
  3. Voorbereiding van de oplossing
    1. Bereid oplossing A als volgt voor: voeg voor elke reactie 29,5 μL Primer Free Rehydration buffer, 2,4 μL 10 μM A. baumannii-F en 10 μM A. baumannii-R en 12,2μL ddH2O toe om een eindvolume van 46,5 μL te bereiken. Vortex en draai kort. Voeg vervolgens het reactiemengsel toe aan de enzymreactiebuisjes uit de RPA-kit. Pipet om te mengen.
      OPMERKING: De primers van A. baumannii-F en R worden gebruikt in de test die gericht is op het A. baumannii-gen . Zie Tabel 1 voor de volgorde.
    2. Bereid oplossing B als volgt aan: voeg voor elke reactie 0,24 μl 10 μM ssDNA-reporter, 2 μl 10x Cas12a-reactiebuffer, 1 μl 1 μM crRNA, 1 μl 1 μM Cas12a en 10,76μl ddH2O toe om een eindvolume van 15 μl te bereiken.
      OPMERKING: De sondes (ssDNA-reporter) werden gekocht en bestonden uit een enkelstrengs DNA-reporter die was gelabeld met een 5-carboxyfluoresceïne (FAM) fluorofoor aan het 5′-uiteinde en een Black Hole Quencher 1 (BHQ1) quencher aan het 3′-uiteinde. In het geval van talrijke monsters die moeten worden gedetecteerd, bereid dan een aanzienlijke hoeveelheid oplossing B en verdeel de monsters later in aliquots.
  4. Isotherme DNA-amplificatie (RPA)
    1. Voeg 1 μl van het positieve recombinante plasmide van 107 kopieën/μl toe aan oplossing A met verschillende primerparen; Meng. Voeg vervolgens 2,5 μL 280 mM magnesiumacetaat (MgOAc) toe aan de oplossing en meng goed.
      OPMERKING: RPA-reacties beginnen zodra MgOAc wordt toegevoegd.
    2. Incubeer gedurende 20 minuten bij 39 °C. Zuiver na 20 minuten de producten die zijn versterkt met verschillende primers met behulp van RPA met een zuiveringskit en laat vervolgens de schone amplicons gedurende 10 minuten op een 1% agarosegel op 120 V draaien om de helderste en breedste band te selecteren als het beste primerpaar.
      OPMERKING: Voor een laag aantal sjabloonkopieën, verwijdert u na 4 minuten de EP-buis, vortex en draait u kort; Plaats het vervolgens nog 16 minuten terug in het verwarmingsapparaat. Na amplificatie moeten buizen met uiterste voorzichtigheid worden geopend om te voorkomen dat werkoppervlakken met amplicons worden besmet. Deze voorzorgsmaatregel verkleint het risico op het induceren van vals-positieve resultaten in daaropvolgende experimentele procedures.
  5. Optimalisatie van RPA-versterkingssysteem
    OPMERKING: Het optimale primerpaar F3R3 dat in de vorige stap is geselecteerd, is ingesteld op verschillende eindconcentraties voor de RPA-amplificatiereactie om de optimale primerconcentratie en -tijd te zeven. NC is een blanco controle voor de bijbehorende primerconcentratie.
    1. Houd de concentraties van de andere componenten constant en het totale volume van 46,5 μl in oplossing A. Pas het volume RNasevrije ddH2O dienovereenkomstig aan om de uiteindelijke primerconcentraties van 10 μM F3 en 10 μM R3 te bereiken bij 0,40 μM (2,0 μl), 0,44 μM (2,2 μl), 0,48 μM (2,4 μl) en 0,52 μM (2,6 μl), respectievelijk.
    2. Incubeer bij 39 °C op verschillende tijdstippen: 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Reinig de RPA-producten met behulp van een DNA-zuiveringskit en voer elektroforese uit op een agarosegel van 1% bij 120 V gedurende 10 minuten om de optimale primerconcentratie en incubatietijden te bepalen door de kenmerken van de banden te analyseren.
  6. Visualisatie van de RPA-CRISPR/Cas12a-test
    1. Voeg 5 μl van het RPA-product toe aan oplossing B en meng grondig tot een homogeen.
    2. Plaats de monsters in het fluorescentie kwantitatieve PCR-instrument, stel het FAM-kanaal in en lees de waarden elke minuut gedurende 60 minuten bij 37 °C, 60x gedurende in totaal 60 minuten.
      OPMERKING: Een groen fluorescentiesignaal kan enkele dagen aanhouden. Om er zeker van te zijn dat het systeem effectief werkt, is het beter om een DNA- en RNase-vrije test uit te voeren.

2. Specificiteitsevaluatie van het op RPA-CRISPR/Cas12a gebaseerde detectieplatform

OPMERKING: Om de specificiteit van A. baumannii-DETECTR te testen, werden de nucleïnezuren van A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia en menselijke monsters onderworpen aan de DETECTR-test.

  1. Gebruik DNA-sjablonen die zijn verkregen van verschillende soorten door de DNA-kit waarnaar wordt verwezen te gebruiken of ze te isoleren door de bacteriën in het water te koken. Zorg ervoor dat alle sjablonen dezelfde concentraties hebben. Gebruik water als negatieve controle.
  2. Voeg 10 ng of 1 μl DNA-sjablonen toe aan oplossing A met F3R3-primers. Voeg 2,5 μl MgOAc toe, meng grondig en incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 39 °C.
  3. Voeg na 20 minuten 5 μL van het product uit de vorige stap toe aan oplossing B en meng.
  4. Plaats het in het fluorescentie kwantitatieve PCR-instrument, stel het kanaal in op FAM en lees de waarde eenmaal per minuut af bij 37 °C, voor een totaal van 60 x gedurende 60 minuten.

3. Gevoeligheidsevaluatie van het op RPA-CRISPR/Cas12a gebaseerde detectieplatform

  1. Gebruik een positief recombinant plasmide, dat is bereid tot een concentratie van 1-107 kopieën/μL, als sjabloon voor de reactie. Gebruik water voor de negatieve controle.
  2. Voer de methode uit door de stappen 2.2-2.4 te volgen.
    OPMERKING: De primerset RPA-F3 en RPA-R3 is ontworpen om een korter fragment van 174 basenparen van het positieve recombinante plasmide te amplificeren.

4. Preparaten terwijl het monster onder UV-licht en LFS-detectie staat

  1. Neem het vereiste aantal teststrips eruit en label ze op de juiste manier.
  2. Breng 10 μL van de geamplificeerde producten van stap 2 en 3 over in afzonderlijke PCR-buisjes. Voeg vervolgens 40 μL ddH2O toe aan elk buisje.
    OPMERKING: Als u een zelf bereid reactiesysteem gebruikt, wordt aanbevolen de optimale verdunningsverhouding te onderzoeken.
  3. Voer de test uit.
    1. Onderwerp de PCR-buis met de geamplificeerde producten aan een transilluminator om de aanwezigheid van fluorescentie te beoordelen.
    2. Plaats de teststrips in de PCR-buisjes met het uiteinde van het monsterkussen naar beneden gericht.
    3. Laat het 5-10 minuten op kamertemperatuur staan om het resultaat af te lezen. Zorg er na deze tijd voor dat het vloeistofpeil de maximale lijn niet overschrijdt voordat u verder gaat.
    4. Interpreteer de resultaten als negatief als de T-lijn geen kleur weergeeft. Interpreteer de resultaten als positief als de T-lijn met het blote oog zichtbaar is, wat aangeeft dat de nucleïnezuursonde is gesplitst door het Cas-enzym en het Cas-enzym is geactiveerd. Beschouw het resultaat als ongeldig als noch de C-lijn, noch de T-lijn kleur vertoont.

Representative Results

Discussion

Traditionele diagnostische methoden voor A. baumannii-infecties hebben verschillende beperkingen waardoor ze minder toegankelijk en haalbaar zijn voor point-of-care-testen27. PCR heeft bijvoorbeeld een goede gevoeligheid en specificiteit, maar vereist gespecialiseerde thermische cyclusapparatuur en complexe workflows die door professionals moeten worden bediend. De hier gepresenteerde nieuwe methode, die RPA- en CRISPR-LbaCas12a-genoombewerking koppelt aan recombineering, bekend als de A. baumannii-DETECTR-test, maakt efficiënte genetische manipulatie mogelijk. Het biedt een snelle, gevoelige en specifieke detectiemethode voor Acinetobacter baumannii-infecties , evenals voor de diagnose van andere bacteriële pathogenen. De workflow wordt geïllustreerd in figuur 1.

Onze methode is bijzonder voordelig bij het diagnosticeren en behandelen van infecties, wat het herstel van de patiënt zou moeten vergemakkelijken en de verspreiding van A. baumannii zou moeten verminderen door de tekortkomingen van bestaande diagnostische technieken te overwinnen. Het A. baumannii-DETECTR-systeem bleek A. baumannii te identificeren met een hoge specificiteit en gevoeligheid (Figuur 5 en Figuur 6). Onze bevindingen toonden aan dat alleen het genoom van A. baumannii een positieve verandering in de fluorescentieplooi vertoonde tijdens de real-time beoordeling, terwijl het genoom van alle andere soorten negatieve resultaten liet zien (Figuur 5).

Om de gevoeligheid van het RPA-CRISPR/Cas12a-detectieplatform te beoordelen, werden recombinante plasmiden pUC57-16s rDNA, die positief zijn voor A. baumannii, gebruikt als doelen om de detectielimiet (LOD) van het systeem te bepalen. In de op fluorescentie gebaseerde RPA-CRISPR/Cas12a-test varieerde de detectie van één kopie per microliter tot 107 kopieën per microliter, met een opmerkelijke verbetering van de fluorescentie-intensiteit waargenomen in de groep met 1 kopie/μL in vergelijking met de negatieve controlegroep (Figuur 6). Belangrijk is dat voor real-time diagnose de resultaten van de detectie direct kunnen worden gevisualiseerd via een draagbaar handheld-apparaat, onafhankelijk van laboratoriumapparatuur, wat essentieel is voor real-time diagnose.

Met betrekking tot het protocol26 moet rekening worden gehouden met verschillende kritische factoren. Ten eerste is het essentieel om kruisbesmetting tijdens het monsterafnameproces te voorkomen, gezien de hoge gevoeligheid van de A. baumannii-DETECTR-test. Bovendien moeten de reactiereagentia worden afgeschermd tegen directe blootstelling aan zonlicht. Het naleven van alle procedurele stappen is cruciaal om de best mogelijke resultaten te bereiken. Een positieve controle, bestaande uit een plasmide dat A. baumannii-specifieke genfragmenten herbergt, moet worden opgenomen om de juiste functionaliteit van het A. baumannii-DETECTR-systeem in praktische toepassingen te verifiëren.

Het protocol laat zien dat parameters kunnen worden geoptimaliseerd voor specifieke laboratoriumomstandigheden en monstertypes, zoals primerconcentratie, reactietijd en andere variabelen. In dit experiment werden de optimale primercombinatie, primerconcentraties en reactietijden voor RPA-amplificatie geselecteerd om de hoogste amplificatie-efficiëntie en specificiteit te produceren. Dit werd bepaald door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 2 en Figuur 3). Bovendien werd een positief recombinant plasmide, dat een geconserveerd gebied van het A. baumannii-genoom bevat, gebruikt als controle om de nauwkeurigheid van het protocol te garanderen. Het is vermeldenswaard dat commerciële bacteriële genomische DNA-extractiekits in dit protocol een gestandaardiseerde en betrouwbare methode bieden voor DNA-extractie. In toekomstige studies kunnen verschillende soorten monsters, zoals klinische of omgevingsmonsters, echter specifieke extractiemethoden vereisen28 om A. baumannii DNA effectief te isoleren.

Bij afwezigheid van detecteerbare fluorescentiesignalen van de positieve controle, is het waarschijnlijk dat er remmers in het reactiemengsel aanwezig zijn, waardoor een vervanging van de reagentia noodzakelijk is. Omgekeerd, als de fluorescentie-intensiteit onvoldoende is voor duidelijke differentiatie, kan het verlengen van de incubatieduur gunstig zijn. Langdurige incubatie kan echter ook leiden tot valse positieven26.

De huidige detectiemethoden voor A. baumannii vereisen het gebruik van dure PCR-apparatuur, vaste operationele locaties en gespecialiseerd personeel. Daarentegen vergemakkelijkt de hierin voorgestelde methode een nauwkeurige en gevoelige diagnose van A. baumannii in veldomgevingen, waardoor het toegankelijk wordt voor een bredere demografie.

De kenmerken van isotherme amplificatie en gegevens die door middel van fluorescentie worden verzameld, maken de A. baumannii-DETCTER-workflow eenvoudig en vereisen weinig apparatuur, en maken het ook mogelijk om snelle detectie van pathogenen uit te voeren in afgelegen gebieden of tijdens uitbraken. RPA-LFS 29,30,31,32, een nieuwe isotherme nucleïnezuuramplificatietechniek, heeft aanzienlijke populariteit gekregen bij de detectie van virale, bacteriële, schimmel- en parasitaire pathogenen dankzij de operationele eenvoud en de verminderde temporele eisen. Het protocol beschrijft het fluorescentiesignaal van het monster onder detectie van ultraviolet (UV) licht of Transilluminator en laterale stroomstroken (LFS). Het kan de afhankelijkheid van zeer nauwkeurige instrumenten en gespecialiseerde technici vermijden, aangezien visuele inspectie in korte tijd resulteert (Figuur 7), waardoor er geen dure en complexe laboratoriumapparatuur en de operationele populatie nodig zijn. Bovendien is de one-tube-methode niet alleen tijdbesparend, maar vermindert het ook het risico op ampliconverontreiniging33.

Toekomstige studies moeten gericht zijn op het verbeteren van de methode om deze werkbaar te maken voor verschillende soorten monsters en verschillende omgevingsomstandigheden, zoals het onderzoeken van efficiëntere en goedkopere DNA-extractietechnieken. Het gebruik van A. baumannii-DETECTR is niet alleen voor klinische diagnose, maar kan ook worden gebruikt voor milieubeoordeling, monitoring en beheer van uitbraken, waardoor gemeenschappen en ziekenhuizen A . baumannii snel kunnen identificeren. Door het crRNA en de primers aan te passen, kan deze moleculaire diagnostische benadering bovendien worden aangepast voor de detectie van verschillende respiratoire bacteriële infecties, zoals Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus en Enterobacter.

Samenvattend kan A. baumannii-DETECTR A. baumannii zo snel en nauwkeurig mogelijk identificeren dankzij de hoge gevoeligheid en specificiteit, het gebruiksvriendelijke ontwerp en de draagbaarheid. Deze methode kan de gezondheidsresultaten van de patiënt verbeteren door tijdige en effectieve behandeling, infectiebeheersing en het verminderen van de proliferatie van antibioticaresistentie te vergemakkelijken, terwijl ook de toenemende dreiging van A. baumannii-infecties wordt aangepakt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
  2. Li, P., et al. Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China. Front Microbiol. 6, 997 (2015).
  3. Wu, X., et al. A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min. J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).
  4. Huang, B., et al. A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573 (2016).
  7. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), eaar6245 (2018).
  8. Xiong, D., et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a. PLoS Biol. 18 (12), e3000978 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  10. Harrington, L. B., et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362 (6416), 839-842 (2018).
  11. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).
  12. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  13. Huang, Z., et al. Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 164, 112316 (2020).
  14. Zhang, W. S., et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection. Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).
  15. Marraffini Luciano, A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).
  16. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147 (2016).
  17. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).
  18. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery. 4 (1), 20 (2018).
  19. Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).
  20. Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nat Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Aquino-Jarquin, G. CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic. Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).
  22. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  23. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  24. Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).
  25. Jiang, Y., et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nat Commun. 8, 15179 (2017).
  26. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).
  27. Ashraf, A., et al. A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis. Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).
  28. Zhu, L., et al. A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya ‘huanong no.1’. Talanta. 277, 126437 (2024).
  29. Zheng, C., et al. Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection. Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).
  30. Wang, Y., et al. Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae. Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813 (2022).
  31. Wang, F., et al. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans. Anal Biochem. 633, 114428 (2021).
  32. Ma, B., et al. A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot. Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).
  33. Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74 (2021).

Tags

Immunology and Infection
Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, X., Duan, M., Zhao, Y., Zhang, K., Liu, F., Jie, J., Li, C., Chen, D., Li, D., Hua, S., Wang, C., Guan, Q., Wu, J., Liu, B., Song, L. Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System. J. Vis. Exp. (218), e67542, doi:10.3791/67542 (2025).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image