إعداد نقطي غون جين وترنسفكأيشن Biolistic من الخلايا العصبية في الثقافة شريحة

Summary

نحن تصف طريقة لإعداد الرصاص الحمض النووي الذهب المطلي وشرح استخدام هذه الرصاصات لtransfect biolistically الخلايا العصبية في قرن آمون شرائح المثقفين.

Abstract

ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية من transfecting خلايا الأنسجة بقذف مع جزيئات الحمض النووي عالية السرعة المغلفة. ونحن نقدم تفصيلية لبروتوكول ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الحصين الفئران ، من الإعداد الأولي من الرصاص الحمض النووي المغلفة لاطلاق النار النهائي الثقافات شريحة عضوي النمط باستخدام مدفع الجينات. الجينات ترنسفكأيشن البندقية وسيلة فعالة وسهلة لtransfecting الخلايا العصبية ومفيد وخاصة بالنسبة للوضع العلامات fluorescently مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا في نسيج شريحة. في هذا الفيديو ، ونحن المخطط الأول الخطوات المطلوبة لجزيئات الذهب معطف مع الحمض النووي. كيف نظهر المقبل إلى خط داخل أنابيب بلاستيكية مع الرصاص الذهب / الحمض النووي ، وكيفية خفض هذه الأنابيب للحصول على خراطيش بلاستيكية للتحميل في البندقية الجينات. وأخيرا ، فإننا أداء ترنسفكأيشن biolistic الثقافات الفئران شريحة الحصين ، مما يدل على التعامل مع بيو راد هيليوس بندقية الجينات ، وتقديم المشورة اطلاق النار المتاعب للحصول على شرائح الأنسجة السليمة وtransfected على النحو الأمثل.

Protocol

بروتوكول للترنسفكأيشن BIOLISTIC

صنع الرصاص

الرصاص جيدة لمدة تصل إلى 6 أشهر ، ولكن قد تبدأ في الانخفاض في الكفاءة ترنسفكأيشن بعد 2-3 أشهر. يجب أن يتم تخزين الرصاص عند درجة 4 في وجود الكريات dessicant. دعونا دائما قوارير التلألؤ ، والتي يتم تخزين الرصاص ، إلى درجة حرارة الغرفة دافئة قبل فتح القارورة.

لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :

• سبيرمدين (0.05M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100 ٪ عالية الدرجة فتحها زجاجة)
• تعقيمها H ₂ 0
• الحمض النووي ليكون transfected
• بوفيدون (PVP - 20 ملغ / مل الأسهم)
• 2 X 15 مل المخروطية (2/bullet مجموعة)
• أنابيب (مقطعة إلى ~ 1 X 30 بوصة مجموعة الرصاص /)
• التلألؤ قوارير (1/bullet مجموعة)
• تجفيف حبيبات
• 10 مل حقنة ث / أنابيب في نهاية

إعداد أنابيب :

1. ~ الجافة 30 بوصة من الأنابيب (حوالي 2 بوصة يمتد إلى أبعد من الحق يا الدائري) في محطة أنابيب ث / N ₂ الغاز (0.4 ضغط) لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.

الحمض النووي على عجل حبات الذهب :

1. تحضير الحمض النووي لتكون في حجم 50 transfected مجموع μmL في أنبوب microcentrifuge (بحد أقصى 50 ميكروغرام مجموع الحمض النووي)
2. تزن من 6-8 ملغ من الذهب ونقل إلى أنبوب microcentrifuge
3. إضافة 100 ميكرولتر من سبيرمدين 0.05M إلى الذهب ويصوتن لمدة 20 ثانية
4. إضافة ميكرولتر 50 من الحمض النووي للذهب / سبيرمدين
5. دوامة (حوالي الإعداد 5) ث / سقف مفتوح
6. إضافة قطرة من الحكمة 100 ميكرولتر من 1M CaCl ₂
7. يصوتن لفترة وجيزة (<5 ثانية)
8. السماح لترسيب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
9. يصوتن لفترة وجيزة

إعداد PVP حل خلال صوتنة :

1. جعل PVP تمييع الحل في مخروطية 15 مل ، 3.5mL تمييع PVP لكل مجموعة من الرصاص (إضافة 7.5 ميكرولتر من الأسهم PVP 20mg/ml إلى 3.5 مل EtOH 100 ٪)

الشطف حبات الذهب مع EtOH :

1. تدور باستمرار حبات الذهب بأقصى سرعة لمدة 10 ثانية في microcentrifuge
2. تجاهل طاف ، ولكن الحفاظ على كمية صغيرة من السائل على حبات الذهب أعلى
3. غسل 3X مع EtOH 1ml ، يصوتن لفترة وجيزة في كل مرة ، إذا لزم الأمر

Resuspend الذهب / الحمض النووي في حل PVP :

1. Resuspend الكرية الذهب في 200 ميليلتر من محلول 3.5 مل PVP / EtOH تمييع
2. دوامة من الذهب لresuspend بيليه (يصوتن لفترة وجيزة إذا لزم الأمر)
3. نقل ميكرولتر 200 من الذهب / PVP حل لالمخروطية الجديدة 15 مليلتر
4. الاستمرار في هذا الطريق ، مضيفا 200 ميكرولتر من PVP في وقت واحد حتى تم نقل كل الذهب إلى 15 مليلتر المخروطية ، والحجم النهائي هو 3.2 مل

طلاء الأنابيب :

1. إيقاف N ₂ في محطة الأنابيب وإزالة الأنابيب المجففة
2. نعلق أنابيب المجفف إلى الحقنة 10 مل
3. هزة بقوة 15 مل المخروطية مليئة الذهب / PVP
4. وضع نهاية للأنابيب في الذهب / حل PVP وتمتص ببطء الحرص على تجنب فقاعات
5. ترك ~ 2 بوصة الجاف من طرفي الأنبوب
6. مع الأنابيب لا تزال تعلق على حقنة ومليئة حل الذهب / PVP والمكان بعناية خلف الأنابيب إلى محطة
7. علامة نهايات الأنابيب حيث يجلس حل
8. اسمحوا الذهب يستقر لمدة 5 دقائق مع حقنة المرفقة
9. تمتص متابعة الحل ببطء شديد عن طريق سحب المحقنة بحيث يتم ترك الذهب استقر خلف (تأكد من عدم غسل الظهر)
10. قطع المحاقن
11. تدوير 90 درجة وترك الجلوس 2 ثانية
12. استدارة 180 درجة وترك الجلوس آخر 2 ثانية
13. تدوير أنبوب لمدة 5 ثوانى
14. بدوره على N ₂ بحيث يقرأ صمام بين 0،4-0،5 وتدور الأنابيب المغلفة الذهب بينما التجفيف لمدة 5 دقائق.

قطع الأنابيب :

1. إزالة أنابيب من محطة الإعدادية وأنابيب وقطع ينتهي عند علامات.
2. وضع قنينة التلألؤ المسمى تحت المروحية أنابيب للقبض على خفض خراطيش
3. أنابيب في مكان المروحية وأنابيب وقطع الأنابيب مع حلاقة نظيفة
4. مكان الكريات الجفاف في قارورة التلألؤ
5. خراطيش المحل في 4 درجات مئوية

اطلاق النار شرائح الأنسجة

عند اطلاق النار شرائح المثقفين ، من المهم أن تستخدم تقنية العقيمة نسبيا من أجل تجنب التلوث. نتذكر ، ان اطلاق النار عندما two بنيات مختلفة ، ويمكن تحميل كل من مجموعات من الرصاص في حامل خرطوشة نفسها ، ولكن ينبغي تغيير برميل والخطوط الملاحية المنتظمة بين البنى الشاشة.

لقد بدأت قبل الحصول على استعداد :

• الرصاص الحمض النووي (لقنينة التلألؤ الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح)
• شرائح الأنسجة
• هيليوس غون جين
• الهيليوم مع خرطوم مدفع دبابة الجين المرفقة </ لى>
• حامل خرطوشة
• بطانة من البلاستيك برميل يا الدائري في المركز
• الناشر (تعديل)
• الناشر الشاشة
• ملقط

الإستعداد البندقية الجينات :

1. ملقط به مكان الذهب خراطيش البلاستيكية المغلفة في حامل الخرطوشة.
2. مكان حامل خرطوشة بندقية في الجينات عن طريق دفع الاول من العام القفل
3. تأمين حامل خرطوشة بقفل
4. الحصول على الخطوط الملاحية المنتظمة للبرميل مع O - الرنين والشاشة الناشر في مكان آمن
5. المسمار للبرميل ، في بطانة البندقية الجينات

اطلاق النار مع شرائح المثقفين البندقية الجينات :

1. توضع على الأذن يفشل
2. المكونات البندقية الجين في توصيل خرطوم صهريج غاز الهليوم
3. بدوره الضغط على دبابة الى 180 PSI
4. تبادل لاطلاق النار في الهواء فارغة من أجل إزالة أي غبار أو الحطام من الشاشة الناشر. تبادل لاطلاق النار في البندقية ، وخفض الزر أولا التعشيق السلامة حتى الصفافير البندقية ، ثم الضغط على الزناد.
5. بعد اطلاق النار على بياض ، وإزالة شرائح من الحاضنة
6. مدفع مقدما لبناء first
7. تبادل لاطلاق النار مع شاشة الناشر حوالي 0،5-1 بوصة من شريحة
8. تقدم خرطوشة بين الآبار.
9. بعد اطلاق النار على مشاركة جيدة ، ضع شرائح العودة إلى الحاضنة
10. إيقاف إطلاق الغاز والضغط قبل فصل البندقية من الهليوم خرطوم
11. فك بطانة للبرميل ، وإزالة خرطوشة وتستخدم قذائف

أصحاب تنظيف خرطوشة وبطانات برميل :

1. خراطيش مكان ، وبطانات للبرميل ، وشاشات الناشر في كوب من الماء والصابون
2. دورق مكان في sonicator الحمام ويصوتن لمدة 20 دقيقة
3. شطف جيدا بالماء حتى يتم إزالة جميع مخلفات الصابون
4. نقع في EtOH 70 ٪ لمدة ساعة
5. منشفة ورقية على مكان جاف لتجف بين عشية وضحاها
6. ويمكن عندئذ خراطيش نظيفة ، وبطانات للبرميل ، ويمكن استخدامها في شاشات transfections biolistic اللاحقة

نصائح لاطلاق النار المتاعب ترنسفكأيشن Biolistic

يمكن ترنسفكأيشن Biolistic نتيجة أحيانا في ظروف دون المستوى الأمثل ترنسفكأيشن. يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل جدا أو العديد من الخلايا transfected جدا ، عالية جدا أو منخفضة جدا مستويات التعبير ، أو قد يسبب شرائح الأنسجة لتصبح غير صحية عموما. كثيرا ما تؤدي شرائح غير صحية من ضغط الانفجار. وهنا بعض النصائح للحصول على شرائح الأنسجة transfected على النحو الأمثل.

إذا كان يبدو أن هناك شرائح غير صحية (أو إذا transfected العديد من الخلايا / شريحة) ، حاول :

• زيادة المسافة اطلاق النار
• خفض الضغط على خزان الغاز
• خفض كمية من الذهب
• الاستغناء عن مركز بيو راد الناشر والاستعاضة عن مركز الشاشة مع الناشر.

إذا transfected خلايا قليلة جدا ، في محاولة :

• تتناقص المسافة اطلاق النار
• تزايد الضغوط على خزان الغاز
• زيادة كمية من الذهب
• زيادة عدد من شرائح الأنسجة / جيد
• تأكد من يا الدائري في بطانة برميل سليمة.

إذا كنت الحصول على شرائح مع كل من خلايا كثيرة جدا وعدد قليل جدا من خلال اطلاق النار transfected نفسه تأكد من :

• التي تحتجز البندقية بشكل متناظر أعلى بكثير
• أن الذهب هو بالتساوي طلاء داخل الأنابيب. (إذا كنت تحصل على خط الذهب ، واستخلاص طاف من أنابيب بمعدل أسرع بمجرد أن استقر الذهب وتدوير الذهب لفترة أطول قبل تحول على النيتروجين. إذا ، من ناحية أخرى ، كنت تحصل streaking من الذهب ، وهذا هو الأرجح بسبب التعرض للرطوبة خلال جعل الكثير من الرصاص : تأكد من أنك تستخدم زجاجة مفتوحة من EtOH أن الأنابيب الجافة بدقة قبل طلاء ، وأنك متوجا الأغطية وإعداد رصاصات في الوقت المناسب).

إذا يبدو ترنسفكأيشن الكفاءة المثلى (transfected # الخلايا / شريحة) ، ولكن يبدو أن مستوى التعبير عالية جدا أو منخفضة جدا :

• ضبط نسبة الحمض النووي إلى الذهب. (على سبيل المثال ، إذا كان منخفضا للغاية الحفاظ على كمية من الذهب ولكن زيادة كمية الحمض النووي).
• ضبط كمية من الوقت بين اطلاق النار وجمع البيانات

في حالة ترنسفكأيشن مزدوجة ، إذا كنت تحصل على القليل جدا من التعبير واحدة من بنيات الخاص ، وضبط نسبة اثنين في يبني بالطريقة المناسبة والتأكد من أن كلا من يبني تحت نفس المروج ، وذلك للتأكد من أن واحدا سوف لا المروج خارج المنافسة من جهة أخرى.

Discussion

ترنسفكأيشن Biolistic هي الوسائل المادية transfecting من الخلايا عبر قصف الأنسجة الحية مع ارتفاع سرعة جزيئات الحمض النووي الذهب المطلي. في نقل الجينات بوساطة الجزيئات ، في الخلايا نتيجة transfected عامة عندما تأتي الرصاصة للراحة في النواة. في حين أن العديد من الأساليب المختلفة موجودة ترنسفكأيشن ، مثل microinjection lipofection ، فوسفات الكالسيوم electroporation ، وترنسفكأيشن ترنسفكأيشن الفيروسي ، ويمكن أن تقترح ترنسفكأيشن biolistic أقل من العمالة المكثفة ، وبديلة فعالة لtransfecting الخلايا التي لا transfected بسهولة باستخدام هذه الأساليب الأخرى. في الواقع ، وقد وضعت لأول مرة كوسيلة لنقل الجينات في النباتات منذ وجود جدار الخلية التي ترنسفكأيشن الصعبة باستخدام أساليب موجودة من قبل ^1. وبالمثل ، فقد اكتسب شعبية biolistics في مجال علم الأعصاب منذ ما بعد الإنقسامية الخلايا العصبية والمعروف أن من الصعب transfect ^2،3. على وجه الخصوص ، ومن المسلم به على نطاق واسع على أنها أسلوب المبدأ لاستخدامها في التجارب التي تهدف إلى تقييم التشكل غرامة قدرها واحد في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح سليمة. وصفت وسائل هنا تقديم شرح مفصل وشامل لكيفية تنفيذ ترنسفكأيشن biolistic من شرائح الدماغ مثقف باستخدام الجينات باليد السلاح (البندقية الجينات هيليوس النظام ؛ بيو راد).

أصبح ترنسفكأيشن Biolistic الأسلوب المفضل لtransfecting الخلايا العصبية في ثقافة شريحة لأنه يسمح ترنسفكأيشن عدد متناثر من الخلايا في جميع أنحاء شريحة الدماغ. في هذه الطريقة ، يمكن فحص الخلايا العصبية الفردية في عزلة. لأن مناسبة بشكل خاص لهذه التقنية transfecting الخلايا العصبية في الدماغ شريحة ، وغالبا ما تستخدم في بالاشتراك مع 2 الفوتون المجهري ، لأن التصور 2 - الفوتون تمكن من استثارة الخلايا fluorescently المسمى عميقة داخل الأنسجة تشتت الضوء ^4. بالفعل تم القبض على تكبير الصور عالية من الخلايا العصبية الهرمية قدم واحدة طوال هذا الفيديو باستخدام مجهر الليزر المخصصة بنيت 2 - الفوتون المسح. في الختام ترنسفكأيشن biolistic هو وسيلة فعالة لtransfecting الخلايا الفردية في سياق كثافة عالية من الخلايا المحيطة بها ، وعلى هذا النحو وقد ثبت مفيدة للغاية لوصفها fluorescently الخلايا العصبية الفردية في الثقافة شريحة العصبية.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).