De voorbereiding van Gene Gun Bullets and biolistische Transfectie van Neuronen in Slice Cultuur

Summary

We beschrijven een methode voor het bereiden van DNA-gecoate goud kogels en demonstreren het gebruik van dergelijke kogels om biolistically transfecteren neuronen in de hippocampus gekweekte plakjes.

Abstract

Biolistische transfectie is een fysiek middel om transfecteren cellen door het bombarderen van weefsel met een hoge snelheid van DNA-gecoate deeltjes. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor biolistische transfectie van rat hippocampale slices, vanaf de eerste voorbereiding van DNA-gecoate kogels aan de laatste opnames van de organotypische slice culturen met behulp van een gen pistool. Gene pistool transfectie is een efficiënte en gemakkelijke manier van transfecteren neuronen en is vooral nuttig voor fluorescent labelen van een kleine subset van cellen in weefsel slice. In deze video, moeten we eerst een overzicht van de stappen die nodig zijn voor het coaten van gouddeeltjes met DNA. We vervolgens zien hoe aan de binnenkant van de plastic buis lijn met de goud / DNA-kogels, en hoe deze buis gesneden om de plastic cartridges te verkrijgen voor het laden in het gen pistool. Tot slot voeren we biolistische transfectie van rat hippocampus slice culturen, waaruit blijkt het hanteren van de Bio-Rad Helios-gen geweer, en het aanbieden van trouble shooting advies aan een gezonde en optimaal getransfecteerd weefsel plakjes te verkrijgen.

Protocol

PROTOCOL VOOR biolistische Transfectie

Het maken van kogels

Kogels zijn goed voor maximaal 6 maanden, maar kan beginnen in de transfectie-efficiëntie afname na 2-3 maanden. Kogels moeten worden bewaard bij 4 ° C in de aanwezigheid van droogmiddel pellets. Altijd laten de scintillatieflesjes, waarin de kogels worden opgeslagen, opwarmen tot kamertemperatuur voor het openen van de flacon.

Voordat u begint zijn klaar:

• Spermidine (0,05 M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100%-high grade-ongeopende fles)
• Geautoclaveerd H ₂ 0
• DNA getransfecteerd worden
• Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml voorraad)
• 2 X 15 ml conische (2/bullet set)
• Buis (gesneden in een X ~ 30 inch / bullet set)
• Scintillatieflesjes (1/bullet set)
• Verdroging pellets
• 10 ml spuit w / buizen op het einde

Bereid slangen:

1. Droge ~ 30 inch van buis (ongeveer 2 cm verder reikt dan rechts O-ring) in de slang station w / N ₂ gas (0,4 druk) gedurende een minimum van 20 minuten.

Neerslaat DNA op goud kralen:

1. Bereid je DNA te worden getransfecteerd in 50 μmL totale volume in microcentrifugebuis (maximaal 50 ug totaal DNA)
2. Weeg 6-8 mg van goud en transfer naar een microcentrifugebuis
3. Voeg 100 ul van 0,05 M spermidine aan goud en ultrasone trillingen gedurende 20 sec
4. Voeg de 50 ul van DNA naar de goud / spermidine
5. Vortex (ongeveer instelling 5) w / kap te openen
6. Voeg druppelsgewijs 100 ul van 1 M CaCl ₂
7. Ultrasone trillingen kort (<5 sec)
8. Laat neerslag gedurende 10 min bij kamertemperatuur
9. Ultrasone trillingen kort

Bereid PVP-oplossing tijdens de ultrasoonapparaat:

1. Maak verdunnen PVP-oplossing in 15 ml conische, 3.5ml verdund PVP voor elke set van kogels (voeg 7,5 pi van 20mg/ml PVP voorraad tot 3,5 ml 100% EtOH)

Spoelen gouden kralen met EtOH:

1. Spin down gouden kralen op volle snelheid voor 10 sec in microcentrifuge
2. Gooi supernatant, maar houd een kleine hoeveelheid vloeistof op de top van gouden kralen
3. Was 3X met 1 ml EtOH, kort met ultrasone trillingen elke keer, indien nodig,

Resuspendeer goud / DNA in PVP-oplossing:

1. Resuspendeer de gouden pellet in 200 pi van de 3,5 ml verdund PVP / EtOH-oplossing
2. Vortex het goud pellet om opnieuw in suspensie (kort met ultrasone trillingen indien nodig)
3. Breng de 200 pi van de goud / PVP-oplossing om een ​​nieuwe 15 ml conische
4. Ga op deze manier, het toevoegen van 200 pi van PVP in een tijd totdat al het goud is overgedragen aan de 15 ml conisch, en het uiteindelijke volume is 3,2 ml

Coating slangen:

1. Schakel N ₂ op de buis station en verwijder de gedroogde slangen
2. Bevestig de gedroogde slang aan de 10 ml spuit
3. Schud de 15 ml conische gevuld met goud / PVP
4. Plaats het uiteinde van de slang in goud / PVP-oplossing en zuigen langzaam en voorzichtig om luchtbellen te vermijden
5. Laat ~ 2 centimeter droog aan beide uiteinden van de buis
6. Met de slang nog aan spuit en gevuld met de goud / PVP-oplossing, plaatst u voorzichtig de slang terug in het station
7. Markeer de uiteinden van de buis waar de oplossing zit
8. Laat het goud voor 5 min te regelen met de spuit bevestigd
9. Suck-up de oplossing heel langzaam door te trekken de spuit, zodat de vaste goud blijft achter (zorg ervoor dat u back-wash)
10. Koppel spuit
11. Draai 90 ° en laat zitten twee seconden
12. 180 ° draaien en laat zitten nog 2 seconden
13. Draai buis voor 5 sec
14. Zet de N _2, zodat de klep leest tussen de 0,4 tot 0,5 en spin de goud gecoate buizen tijdens het drogen gedurende 5 minuten.

Snijden slangen:

1. Verwijder de slang van de buis prep-station en snijd de uiteinden bij de merken.
2. Zet een label scintillatieflesje onder de slang helikopter te snijden cartridges te vangen
3. Plaats buizen in de slang chopper en snijd de slang met schoon scheermes
4. Plaats een verdroging pellets in scintillatieflesje
5. Bewaar cartridges bij 4 ° C

Schieten Tissue Slices

Bij het fotograferen gekweekte plakken, is het belangrijk om een ​​relatief steriele techniek gebruiken om besmetting te voorkomen. Vergeet niet dat bij het opnemen van twee verschillende constructen, beide reeksen kogels kunnen worden geladen in dezelfde cartridge houder, maar het vat-liner en het scherm moet worden veranderd tussen de constructen.

Voordat u begint zijn klaar:

• DNA bullets (laten scintillatieflesje opwarmen tot kamertemperatuur voordat u deze opent)
• Weefsel plakken
• Helios Gene Gun
• Helium tank met gen pistool slang </ Li>
• Patroonhouder
• Vat liner met kunststof O-ring op zijn plaats
• Diffuser (gewijzigd)
• Diffuser Screen
• Pincet

Prepping het gen gun:

1. Met behulp van een tang plaats het goud gecoate plastic patronen in de patroonhouder.
2. Plaats de cartridge houder in het gen pistool door eerst het terugdringen van sluis
3. Bevestig de patroonhouder met slot
4. Verkrijgen van een vat liner met een O-ring en de diffuser scherm stevig op zijn plaats
5. Schroef de barrel-liner in het gen pistool

Schieten gekweekt plakjes met het gen pistool:

1. Zet oorkappen
2. Steek het gen pistool in de slang aangesloten Helium gas tank
3. Zet druk op de tank tot 180 PSI
4. Schiet een leeg in de lucht om stof of vuil uit de diffusor scherm te verwijderen. Om het pistool schieten, eerst druk van de veiligheid vergrendeling knop ingedrukt totdat het pistool piept, trek vervolgens de trekker over.
5. Na de opname van de lege, verwijder de plakjes uit de incubator
6. Advance pistool om eerst te bouwen
7. Schieten met de diffuser-scherm ongeveer 0,5 - 1 inch van de slice
8. Vooraf de cartridge tussen de putten.
9. Na de opname van de laatste goed, terug te plaatsen de plakjes in de incubator
10. Schakel gas en laat de druk Voordat u het geweer van de Helium slang
11. Schroef het vat liner, en verwijder de cartridge en de gebruikte schalen

Reinigingscartridge houders en vat liners:

1. Plaats cartridges, vat liners, en diffuser schermen in een bekerglas met water en zeep
2. Plaats beker in bad ultrasoonapparaat en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten
3. Grondig afspoelen met water tot alle zeepresten verwijderd zijn
4. Soak in 70% EtOH voor een uur
5. Plaats op droog papier handdoek 's nachts om te drogen
6. Schoon cartridges, vat liners, en schermen kunnen worden hergebruikt in de daaropvolgende biolistische transfecties

Trouble shooting tips voor biolistische Transfectie

Biolistische transfectie kan soms resulteren in een suboptimale transfectie omstandigheden. Het kan leiden tot te weinig of te veel cellen getransfecteerd, te hoge of te lage expressie niveaus, of kan leiden tot weefsel plakjes te worden over het algemeen ongezond. Vaak ongezonde plakjes gevolg van de druk ontploffing. Hier zijn enkele tips om optimaal te getransfecteerde weefsel plakjes te verkrijgen.

Als plakjes lijken te zijn ongezond (of als er te veel cellen worden getransfecteerd / slice), probeer dan:

• toenemende opnameafstand
• afnemende druk op de gas tank
• het verminderen van de hoeveelheid goud
• uitsnijden van het centrum van de Bio-Rad diffuser en het vervangen van het centrum met een diffuser scherm.

Als er te weinig cellen worden getransfecteerd, probeer dan:

• afnemende opnameafstand
• toenemende druk op gas tank
• het verhogen van de hoeveelheid goud
• verhoging van het aantal van weefsel plakjes / goed
• Zorg ervoor dat de O-ring in het vat-liner intact is.

Als u plakjes te krijgen met zowel te veel en te weinig cellen getransfecteerd in dezelfde schieten er zeker van:

• dat u houdt het pistool symmetrisch bovenstaande goed
• dat goud is gelijkmatig coaten van de binnenzijde van de slang. (Als u het krijgen van een lijn van goud, trekken uit het supernatans van de slang in een sneller tempo als het goud is geregeld en de gouden langer voordat het inschakelen van de stikstof te draaien. Als, aan de andere kant, je krijgt strepen van goud Dit is waarschijnlijk het gevolg van te veel vocht blootstelling tijdens bullet maken: zorg ervoor dat u een ongeopende fles EtOH gebruikt, dat de slang goed droog is voordat coating, en dat u aftopping deksels en het voorbereiden van kogels in een tijdig).

Als transfectie-efficiëntie lijkt een optimale (# cellen getransfecteerd / slice), maar de uitdrukking niveau lijkt te hoog of te laag:

• aanpassen van de verhouding tussen DNA naar goud. (Bijv. als het te laag is behoud van de hoeveelheid goud, maar verhoging van het bedrag van het DNA.)
• aanpassen van de hoeveelheid tijd tussen opname en het verzamelen van gegevens

In het geval van duale transfectie, als je krijgt te weinig uitdrukking van een van uw construeert, pas de verhouding van de twee constructies in de passende wijze en zorg ervoor dat beide constructen zijn onder dezelfde promotor, om zeker te maken dat een promotor zal niet uit-concurrentiebedingen de andere.

Discussion

Biolistische transfectie is een fysische weg van transfecteren cellen via bombardement van levend weefsel met een hoge snelheid van DNA-gecoate gouddeeltjes. In deeltje gemedieerde gen-overdracht, resulteren in het algemeen getransfecteerde cellen wanneer de kogel tot rust komt in de kern. Hoewel veel verschillende transfectie methoden bestaan, zoals micro-injectie, lipofectie, calcium-fosfaat transfectie, elektroporatie en virale transfectie, kan biolistische transfectie bieden een minder arbeidsintensief, en efficiënt alternatief voor transfecteren cellen die niet gemakkelijk worden getransfecteerd met behulp van deze andere methoden. In feite, werd eerst ontwikkeld als een techniek voor gentransfer in planten omdat de aanwezigheid van de celwand gemaakt transfectie moeilijk met behulp van reeds bestaande methoden ^1. Ook heeft biolistics aan populariteit gewonnen op het gebied van de neurobiologie, omdat post-mitotische neuronen zijn notoir moeilijk te ^2,3 transfecteren. In het bijzonder wordt algemeen erkend als het principe techniek die wordt gebruikt in experimenten die gericht zijn op het beoordelen van fijne morfologie van enkele neuronen in de hersenen intact plakjes. De beschreven methoden hier een gedetailleerde en uitvoerige uitleg over hoe biolistische transfectie van gekweekte hersenen plakjes uit te voeren met behulp van een hand gehouden gen-gun (de Helios Gene Gun systeem, Bio-Rad).

Biolistische transfectie is uitgegroeid tot de aangewezen methode voor transfecteren neuronen in slice cultuur omdat het toelaat transfectie van een dunne aantal cellen in de hersenen slice. Op deze manier kunnen individuele neuronen worden onderzocht in isolement. Omdat deze techniek is vooral geschikt voor transfecteren neuronen in de hersenen slice, wordt het vaak gebruikt in combinatie met twee-foton microscopie, sinds 2-foton excitatie maakt visualisatie van fluorescent gelabelde cellen diep in lichtverstrooiing weefsel ^4. Inderdaad de hoge vergroting beelden van een piramidale neuronen gepresenteerd in deze video werden vastgelegd met behulp van een custom-built twee-foton laser scanning microscoop. Tot slot biolistische transfectie is een efficiënt middel van transfectie individuele cellen binnen de context van een hoge dichtheid van de omringende cellen, en als zodanig heeft bewezen zeer nuttig zijn voor fluorescent etikettering van individuele neuronen in neuronale slice cultuur.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).