Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von DNA beschichteten Gold-Kugeln und zeigen die Verwendung solcher Geschosse zu biolistically transfizieren Neuronen in kultivierten Hippocampus-Schnitten.

Abstract

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen durch den Beschuss Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Partikel. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll für biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheiben, von der ersten Herstellung von DNA-ummantelten Kugeln um die letzten Schießen der organotypischen Kulturen mit einer Gen-Kanone. Gene gun Transfektion ist eine effiziente und einfach mittels Transfektion von Neuronen und ist besonders nützlich für Fluoreszenzmarkierung eine kleine Untergruppe von Zellen im Gewebe zu schneiden. In diesem Video haben wir zunächst einen Überblick über die erforderlichen Schritte zu beschichten Goldpartikel mit DNA. Wir nächsten demonstrieren, wie auf der Innenseite der Kunststoffschlauch mit dem Gold / DNA Kugeln Linie, und wie man diese Rohre geschnitten, um die Kunststoff-Patronen zum Laden in den Gen-Kanone zu erhalten. Schließlich führen wir biolistischen Transfektion von Ratten-Hippocampus Scheibe Kulturen demonstrieren Umgang mit dem Bio-Rad Helios Gene Gun, und bietet Fehlersuche Ratschläge für gesunde und optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten.

Protocol

PROTOKOLL FÜR biolistischen TRANSFEKTION

Erstellen Kugeln

Bullets sind gut für bis zu 6 Monate, kann aber anfangen, in Transfektionseffizienz nach 2-3 Monaten zu verringern. Bullets sollte bei 4 ° C in Anwesenheit von Trockenmittel Pellets gelagert werden. Lassen Sie immer das Szintillationsgefäße, in denen Kugeln gespeichert sind, auf Raumtemperatur erwärmt vor dem Öffnen der Flasche.

Bevor Sie beginnen müssen bereit:

• Spermidin (0,05 M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100%-high grade-ungeöffnete Flasche)
• Autoklaviert H ₂ 0
• DNA zu transfizieren
• Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml Stammlösung)
• 2 X 15 ml konisch (2/bullet set)
• Tubing (Schnitt in 1 X ~ 30 Zoll / Kugel gesetzt)
• Szintillationsgefäße (1/bullet set)
• Austrocknung Pellets
• 10 ml Spritze w / Schläuche am Ende

Bereiten Schlauch:

1. Dry ~ 30 Zoll-Schlauch (ungefähr 2 Zoll, die über rechten O-Ring) in den Schlauch Station w / N _2-Gas (0,4 Druck) für mindestens 20 min.

Ausfallende DNA auf Gold Perlen:

1. Bereiten DNA in 50 μmL Gesamtvolumen in Mikrozentrifugenröhrchen (maximal 50 ug Gesamt-DNA) transfiziert werden
2. Abwiegen 6-8 mg Gold und Überweisung auf ein Mikrozentrifugenröhrchen
3. 100 l 0,05 M Spermidin, um Gold und beschallen für 20 sec
4. Fügen Sie die 50 ul DNA, um das Gold / Spermidin
5. Vortex (rund Einstellung 5) w / cap öffnen
6. Fügen Sie tropfenweise 100 ul 1M CaCl ₂
7. Ultraschallbad kurz (<5 sec)
8. Absetzen lassen für 10 Minuten bei Raumtemperatur
9. Ultraschallbad kurz

Bereiten Sie PVP-Lösung während der Beschallung:

1. Machen Sie verdünnten PVP-Lösung in 15 ml konisch, 3.5ml verdünnten PVP für jeden Satz von Kugeln (add 7,5 ul der 20mg/ml PVP Lager zu 3,5 ml 100% EtOH)

Spülen Goldperlen mit EtOH:

1. Spin down Goldperlen bei voller Geschwindigkeit für 10 Sekunden in Mikrozentrifuge
2. Überstand, aber halten Sie eine kleine Menge der Flüssigkeit auf der Goldperlen
3. Waschen mit 1 ml EtOH 3X, kurz beschallen jedes Mal, wenn nötig

Resuspendieren gold / DNA in PVP-Lösung:

1. Resuspendieren Gold Pellet in 200 ul der 3,5 ml verdünnten PVP / EtOH-Lösung
2. Vortex das Gold Pellet zu resuspendieren (kurz beschallen falls erforderlich)
3. Übertragen Sie die 200 ul von Gold / PVP-Lösung zu einem neuen 15 ml konischen
4. Fahren Sie auf diese Art und Weise, Zugabe von 200 ul von PVP in einer Zeit, bis alles Gold ist, die 15 ml konische übertragen worden, und das Endvolumen beträgt 3,2 mL

Coating-Schlauch:

1. Schalten N ₂ bei der Schlauch-Station und nehmen Sie getrocknete Schlauch
2. Bringen getrocknet Schlauch an den 10 ml-Spritze
3. Kräftig schütteln 15 ml konisch mit gold / PVP gefüllt
4. Das Ende des Schlauches in gold / PVP-Lösung und saugen sich langsam darauf achten, um Blasen zu vermeiden
5. Lassen Sie ~ 2 Zoll trocken von beiden Enden des Rohres
6. Mit dem Schlauch noch Spritze befestigt und mit dem Gold / PVP-Lösung, vorsichtig die Schläuche wieder in die Station
7. Mark die Enden des Rohres, wo die Lösung liegt
8. Lassen Sie das Gold für 5 Minuten absetzen mit der Spritze befestigt
9. Suck-up die Lösung sehr langsam, indem Sie die Spritze so, dass die ständige Gold hinter sich (vergewissern Sie sich, um Back-wash) links
10. Trennen Sie die Spritze
11. Um 90 ° und lassen Sie sich 2 Sekunden
12. Um 180 ° drehen und lassen Sie sich weitere 2 Sekunden
13. Drehen Rohr für 5 Sek.
14. Schalten Sie die N _2, so dass das Ventil liest zwischen 0,4 bis 0,5 und drehen Sie das gold-beschichtete Schlauch während der Trocknung für 5 min.

Cutting-Schlauch:

1. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Schlauch prep-Station und schneiden Sie die Enden an den Markierungen.
2. Setzen Sie ein markiertes Scintillationsfläschchen unter dem Schlauch Chopper zu schneiden Patronen zu fangen
3. Legen Sie Schlauch in das Rohr Chopper und schneiden Sie den Schlauch mit sauberen Rasierklinge
4. Legen Sie eine Austrocknung Pellets in Scintillationsfläschchen
5. Lagern Sie Kassetten bei 4 ° C

Shooting Gewebeschnitten

Bei der Aufnahme von kultivierten Scheiben, ist es wichtig, eine relativ sterile Technik einzusetzen, um Kontaminationen zu vermeiden. Denken Sie daran, dass bei der Aufnahme von zwei verschiedenen Konstrukte, beide Sätze von Kugeln in der gleichen Patronenhalter geladen werden kann, aber der Lauf-Liner und Bildschirm sollte zwischen Konstrukten verändert werden.

Bevor Sie beginnen müssen bereit:

• DNA Kugeln (let Scintillationsfläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor)
• Gewebeschnitten
• Helios Gene Gun
• Helium-Tank mit Gen-Kanone Schlauch angebracht </ Li>
• Kartuschenhalter
• Barrel-Liner mit Kunststoff-O-Ring an seinem Platz
• Diffuser (modifiziert)
• Streuscheibe
• Zange

Prepping der Gen-Kanone:

1. Mit einer Pinzette Ort der mit Gold beschichteten Kunststoff-Patronen in den Patronenhalter.
2. Setzen Sie den Patronenhalter in die Gen-Kanone, indem Sie zuerst Zurückschieben lock
3. Sichern Sie den Patronenhalter mit Schloss
4. Besorgen Sie sich einen Barrel-Liner mit einem O-Ring und der Diffusor Bildschirm sicher in Position
5. Schrauben Sie die Lauf-Liner in die Gen-Kanone

Shooting kultivierten Scheiben mit der Gen-Kanone:

1. Setzen Sie auf Gehörschutz
2. Stecken Sie den Gen-Kanone in Schlauch verbunden Helium-Gas-Tank
3. Schalten Sie den Druck auf Tank bis 180 PSI
4. Nehmen Sie ein leeres in die Luft, um Staub und Schmutz aus dem Diffusor Bildschirm zu entfernen. Um die Waffe zu schießen, zuerst drücken Sie die Sicherheitsverriegelung drücken, bis die Waffe piept, dann abdrücken.
5. Nach der Aufnahme des Rohlings, entfernen Sie die Scheiben aus dem Inkubator
6. Advance-Pistole an erste Konstrukt
7. Schießen Sie mit dem Diffusor-Bildschirm über 0,5 bis 1 Zoll von der Scheibe
8. Schieben Sie die Patrone zwischen den Wells.
9. Nach der Aufnahme der letzten gut, legen Sie die Scheiben wieder in den Inkubator
10. Schalten Sie Gas-und Lösedruck vor dem Abnehmen der Pistole aus dem Helium-Schlauch
11. Lösen Sie den Lauf-Liner, und entfernen Sie die Patrone und die verwendeten Schalen

Reinigungskassette Inhaber und Lauf-Liner:

1. Legen Sie Patronen, Fass-Linern und Diffusor-Bildschirme in ein Becherglas mit Seifenwasser
2. Legen Becher in Ultraschallbad und beschallen für 20 min
3. Gründlich mit Wasser ausspülen, bis alle Seifenreste entfernt werden
4. Tauchen Sie ein in 70% EtOH für eine Stunde
5. Legen Sie auf trockenen Papiertuch über Nacht zu trocknen
6. Reinigen der Patronen, Fass-Linern und Bildschirmen kann dann in nachfolgenden biolistischen Transfektionen wiederverwendet werden

Fehlersuche Tipps für Biolistic Transfektion

Biolistic Transfektion kann manchmal zu einer suboptimalen Transfektionsbedingungen führen. Es kann zu wenige oder zu viele Zellen transfiziert, zu hohe oder zu niedrige Expression führen können oder Gewebeschnitten dazu führen, dass sich in der Regel gesund. Oft ungesund Scheiben ergeben sich aus der Druckwelle. Hier sind einige Tipps, um optimal transfiziert Gewebeschnitte zu erhalten.

Wenn Scheiben scheinen ungesund sein (oder, wenn zu viele Zellen / Scheibe transfiziert), versuchen Sie:

• zunehmende Aufnahmeabstand
• abnehmendem Druck auf Gastank
• Verringerung der Menge an Gold
• Ausschneiden der Mitte des Bio-Rad-Diffusor und Ersetzen der Mitte mit einer Streuscheibe.

Wenn zu wenige Zellen transfiziert sind, versuchen Sie:

• abnehmender Aufnahmeabstand
• zunehmenden Druck auf die Gas-Tank
• Erhöhung der Menge von Gold
• Erhöhung der Anzahl von Gewebeschnitten / well
• sicherstellen, dass die O-Ring in den Lauf-liner ist intakt.

Wenn Sie Slices erhalten sowohl mit zu vielen und zu wenigen Zellen während der gleichen Aufnahmebedingungen stellen Sie sicher, transfiziert:

• dass Sie mit der Waffe symmetrisch über gut
• dass Gold gleichmäßig Beschichtung der Innenseite der Rohre. (Wenn Sie immer eine Reihe von Gold sind, ziehen den Überstand vom Schlauch mit einer schnelleren Rate, wenn das Gold abgesetzt hat, und drehen Sie das Gold mehr, bevor Sie den Stickstoff. Wenn auf der anderen Seite bekommen Sie Streifenbildung von Gold Dies ist wahrscheinlich auf zu viel Feuchtigkeit Exposition während der Kugel machen: stellen Sie sicher, Sie verwenden eine ungeöffnete Flasche EtOH, dass der Schlauch gründlich vor der Beschichtung trocken, und dass Sie Capping Deckel und Vorbereitung Kugeln in einer fristgerechten Weise).

Wenn Transfektionseffizienz scheint optimal (#-Zellen transfiziert / Stück), aber der Ausdruck Ebene scheint zu hoch oder zu niedrig:

• Anpassung des Verhältnisses DNA zu Gold. (ZB wenn sie zu niedrig halten die Menge des Goldes, sondern die Menge an DNA.)
• Anpassung der Höhe der Zeit zwischen Aufnahme-und Datenerfassung

Im Falle von Dual-Transfektion, wenn Sie auch zu wenig Ausdruck eines Ihrer Konstrukte, passen Sie das Verhältnis der beiden Konstrukte in geeigneter Weise und stellen Sie sicher, dass beide Konstrukte unter den gleichen Promotor, so stellen Sie sicher, dass man Promotor wird nicht out-Wettbewerb der anderen Seite.

Discussion

Biolistic Transfektion ist eine physikalische Mittel zur Transfektion von Zellen über Beschuss von lebendem Gewebe mit hoher Geschwindigkeit DNA beschichtete Goldpartikel. In der Teilchen-vermittelten Gentransfer im Allgemeinen transfizierten Zellen entstehen, wenn die Kugel kommt in den Kern ruhen. Während viele verschiedene Transfektion Methoden existieren, wie Mikroinjektion, Lipofektion, Calcium-Phosphat-Transfektion, Elektroporation und virale Transfektion kann biolistischen Transfektion bieten eine weniger arbeitsintensiv und effiziente Alternative zur Transfektion von Zellen, die nicht einfach sind, transfiziert mit diesen anderen Methoden. In der Tat war es zunächst als eine Technik für den Gentransfer in Pflanzen entwickelt, da das Vorhandensein der Zellwand aus Transfektion schwierig mit existierenden Methoden ^1. Ebenso hat Biolistik Popularität auf dem Gebiet der Neurobiologie gewonnen, da post-mitotischen Neuronen notorisch schwer zu ^2,3 transfizieren sind. Insbesondere ist es weithin als das Prinzip Technik, um in Experimenten bei der Beurteilung feinen Morphologie der einzelnen Neuronen im intakten Gehirn Scheiben sollen verwendet werden anerkannt. Die hier beschriebenen Methoden liefern eine detaillierte und umfassende Erklärung, wie biolistischen Transfektion von kultivierten Hirnschnitten durchführen mit einer Hand gehalten Gen-Kanone (die Helios Gene Gun-System; Bio-Rad).

Biolistic Transfektion ist die bevorzugte Methode zur Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur, weil es die Transfektion von einem spärlichen Anzahl von Zellen im Gehirn Scheibe ermöglicht. Auf diese Weise können einzelne Neuronen isoliert betrachtet werden. Da diese Technik eignet sich besonders gut zur Transfektion von Neuronen im Gehirn Scheibe geeignet, ist es oft in Verbindung mit 2-Photonen-Mikroskopie verwendet, da 2-Photonen-Anregung ermöglicht die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen tief im Lichtstreuung Gewebe ^4. In der Tat die hohe Vergrößerung Bilder einzelner Pyramidenneuronen in diesem Video vorgestellt wurden unter Verwendung einer speziell angefertigten 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop. Abschließend biolistischen Transfektion ist ein effizientes Mittel zur Transfektion von einzelnen Zellen im Kontext einer hohen Dichte von umgebenden Zellen, und als solche hat sich als extrem nützlich für die Fluoreszenzmarkierung einzelner Neuronen in neuronalen Stück Kultur.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
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