जीन गन बुलेट और स्लाइस संस्कृति में न्यूरॉन्स की Biolistic अभिकर्मक की तैयारी

Summary

हम डीएनए लेपित सोने गोलियों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन है और ऐसी गोलियों के उपयोग को biolistically सुसंस्कृत hippocampal स्लाइस में न्यूरॉन्स transfect प्रदर्शित.

Abstract

Biolistic अभिकर्मक उच्च वेग डीएनए लेपित कणों के साथ ऊतक बौछार से कोशिकाओं transfecting के एक भौतिक साधन है. हम चूहे hippocampal स्लाइस के biolistic अभिकर्मक के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, डीएनए लेपित गोलियों की प्रारंभिक तैयारी से organotypic टुकड़ा एक जीन बंदूक का इस्तेमाल संस्कृतियों के अंतिम शूटिंग. जीन बंदूक अभिकर्मक transfecting न्यूरॉन्स के एक कुशल और आसान साधन है और fluorescently ऊतक टुकड़ा में एक कोशिकाओं के छोटे सबसेट लेबलिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इस वीडियो में, हम पहले कोट डीएनए के साथ सोने के कणों के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा. हम अगले प्रदर्शन कैसे सोने / डीएनए गोलियों के साथ प्लास्टिक टयूबिंग के अंदर लाइन के लिए, और कैसे इस टयूबिंग कटौती करने के लिए जीन बंदूक में लोड करने के लिए प्लास्टिक कारतूस प्राप्त. अंत में, हम चूहे hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों के biolistic अभिकर्मक प्रदर्शन, जैव रेड से निपटने का प्रदर्शन जीन बंदूक Helios, और मुसीबत शूटिंग सलाह की पेशकश करने के लिए स्वस्थ और बेहतर ट्रांसफ़ेक्ट ऊतक स्लाइस प्राप्त.

Protocol

BIOLISTIC अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल

बुलेट बनाना

बुलेट 6 महीनों के लिए अच्छे हैं, लेकिन 2-3 महीनों के बाद अभिकर्मक दक्षता में कमी करने के लिए शुरू कर सकते हैं. बुलेट dessicant छर्रों की उपस्थिति में 4 ° C में संग्रहित किया जाना चाहिए. हमेशा जगमगाहट शीशियों, जिसमें बुलेट्स संग्रहीत किए जाते हैं शीशी खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करते हैं.

पहले शुरू हो रही तैयार है:

• Spermidine (0.05M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100% उच्च ग्रेड बंद बोतल)
• Autoclaved ₂ एच 0
• डीएनए ट्रांसफ़ेक्ट हो
• Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 शेयर मिलीग्राम / एमएल)
• 2 एक्स 15 मिलीलीटर शंक्वाकार (2/bullet सेट)
• ट्यूबिंग (1 में कटौती X ~ 30 इंच गोली सेट /)
• जगमगाहट शीशियों (1/bullet सेट)
• Desiccation छर्रों
• 10 मिलीलीटर w सिरिंज / अंत पर टयूबिंग

टयूबिंग तैयार:

1. ड्राई ~ टयूबिंग की टयूबिंग स्टेशन w / N ₂ गैस (0.4 दबाव) 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए 30 इंच (के बारे में 2 इंच सही हे - अंगूठी से परे का विस्तार).

सोने की माला पर डीएनए precipitating:

1. डीएनए तैयार microcentrifuge ट्यूब में 50 μmL कुल मात्रा (अधिकतम 50 μg कुल डीएनए) में ट्रांसफ़ेक्ट
2. सोने की 6-8 मिलीग्राम वजन और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण
3. सोने के लिए 0.05M spermidine के 100 μL जोड़ें और 20 सेकंड के लिए sonicate
4. सोने / spermidine के लिए डीएनए के 50 μL जोड़ें
5. भंवर (5 सेटिंग आसपास) w / टोपी खुला
6. 1M CaCl ₂ के बुद्धिमान 100 μL बूंद जोड़ें
7. Sonicate संक्षिप्त (<5 सेकंड)
8. कमरे Temp पर 10 मिनट के लिए वेग करने की अनुमति दें
9. संक्षिप्त Sonicate

Sonication के दौरान PVP समाधान तैयार:

1. गोलियों के प्रत्येक सेट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार, 3.5mL पतला PVP में PVP समाधान (3.5 मिलीलीटर 100% EtOH 20mg/ml PVP स्टॉक के 7.5 μL जोड़ने) पतला करें

EtOH के साथ सोने के मोती Rinsing:

1. नीचे microcentrifuge में 10 सेकंड के लिए सोने की माला पूरी गति में स्पिन
2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, लेकिन सोने की माला के शीर्ष पर तरल की एक छोटी राशि रखने
3. 1ml EtOH साथ 3X धो है, संक्षेप में हर बार sonicate, यदि आवश्यक हो तो

Resuspend / PVP समाधान में सोने डीएनए:

1. सोने में 3.5 मिलीलीटर पतला समाधान / PVP EtOH के 200 μL गोली Resuspend
2. सोने resuspend करने के लिए गोली भंवर (संक्षेप में sonicate यदि आवश्यक)
3. एक नया 15 एमएल शंक्वाकार सोने / PVP समाधान के 200 μL स्थानांतरण
4. इस रास्ते में जारी रखें, एक समय में PVP की 200 μL जोड़ने जब तक सभी 15 एमएल शंक्वाकार सोने स्थानांतरित किया गया है, और अंतिम मात्रा 3.2 एमएल है

कोटिंग टयूबिंग:

1. टयूबिंग स्टेशन पर ₂ एन मुड़ें टयूबिंग और सूखे को दूर
2. 10 मिलीलीटर सिरिंज सूखे टयूबिंग संलग्न
3. सख्ती शेक 15 एमएल शंक्वाकार स्वर्ण / PVP से भरा
4. सोने में टयूबिंग / PVP समाधान के अंत प्लेस और चूसना जा रहा है धीरे धीरे बुलबुले से बचने सावधान
5. टयूबिंग के दोनों सिरों से ~ 2 इंच सूखी छोड़ दो
6. साथ टयूबिंग अभी भी सिरिंज से जुड़ी है और सोने / PVP समाधान के साथ भरा, ध्यान टयूबिंग स्टेशन में वापस जगह
7. टयूबिंग जहां समाधान बैठता के समाप्त होता है मार्क
8. चलो सोने सिरिंज संलग्न के साथ 5 मिनट के लिए व्यवस्थित
9. सिरिंज ताकि बस सोने के पीछे छोड़ दिया है (वापस धोने के लिए यकीन नहीं कर) खींच कर समाधान चूसो बहुत धीरे धीरे
10. सिरिंज डिस्कनेक्ट
11. 90 ° घुमाएँ और 2 सेकंड बैठते हैं
12. 180 ° घुमाएँ और एक और 2 सेकंड बैठते हैं
13. 5 सेकंड के लिए ट्यूब घुमाएँ
14. ₂ एन पर मुड़ें इतना है कि वाल्व 0.4 के बीच लिखा है - 0.5 और सोने में लिपटे टयूबिंग स्पिन जबकि 5 मिनट के लिए सुखाने.

टयूबिंग काटना:

1. टयूबिंग प्रस्तुत करने का स्टेशन से टयूबिंग निकालें और बंद निशान पर समाप्त होता है कटौती.
2. टयूबिंग हेलिकॉप्टर के तहत एक लेबल जगमगाहट शीशी रख कटौती कारतूस को पकड़ने
3. टयूबिंग हेलिकॉप्टर में रखें टयूबिंग और साफ रेजर के साथ टयूबिंग कटौती
4. जगमगाहट शीशी में एक desiccation छर्रों प्लेस
5. 4 में स्टोर कारतूस डिग्री सेल्सियस

ऊतक स्लाइस की शूटिंग

जब शूटिंग सुसंस्कृत स्लाइस, यह महत्वपूर्ण है एक अपेक्षाकृत बाँझ तकनीक रोजगार क्रम में संक्रमण से बचने. याद रखें, कि जब दो अलग अलग constructs शूटिंग, गोलियों की दोनों सेट समान कारतूस धारक में लोड किया जा सकता है, लेकिन बैरल लाइनर और स्क्रीन constructs के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए.

पहले शुरू हो रही तैयार है:

• डीएनए बुलेट्स (जगमगाहट शीशी खोलने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म चलो)
• ऊतक स्लाइस
• जीन गन Helios
• जीन बंदूक की नली के साथ हीलियम टैंक संलग्न </ Li>
• कारतूस धारक
• प्लास्टिक के साथ बैरल लाइनर जगह में O-अंगूठी
• विसारक (संशोधित)
• विसारक स्क्रीन
• चिमटा

जीन बंदूक prepping:

1. का प्रयोग संदंश कारतूस धारक में सोने लेपित प्लास्टिक कारतूस जगह है.
2. पहली बार वापस ताला धक्का द्वारा जीन बंदूक में कारतूस धारक प्लेस
3. ताला के साथ कारतूस धारक सुरक्षित
4. एक O-अंगूठी और जगह में विसारक सुरक्षित स्क्रीन के साथ एक बैरल लाइनर प्राप्त
5. जीन बंदूक में बैरल लाइनर भाड़

जीन बंदूक के साथ शूटिंग सुसंस्कृत स्लाइस:

1. कान muffs पर रखो
2. नली जुड़ा हीलियम गैस टैंक में जीन बंदूक प्लग
3. 180 साई मुड़ें टैंक पर दबाव
4. हवा में एक खाली गोली मारो क्रम में किसी भी या विसारक स्क्रीन से धूल और मलबे को हटाने. बंदूक गोली मार करने के लिए, पहले बंदूक beeps जब तक सुरक्षा गूंथ बटन दबाना है, तो ट्रिगर खींच.
5. रिक्त शूटिंग के बाद, मशीन से स्लाइस हटायें
6. अग्रिम करने के लिए पहली बार बंदूक का निर्माण
7. 0.5 के बारे में विसारक स्क्रीन के साथ मारो - से 1 इंच टुकड़ा
8. कुओं के बीच कारतूस अग्रिम.
9. अच्छी तरह से पिछले शूटिंग के बाद, स्लाइस इनक्यूबेटर में वापस जगह
10. पहले हीलियम नली से बंदूक detaching गैस और रिलीज के दबाव मुड़ें
11. खोल देना बैरल लाइनर, और कारतूस हटाने और प्रयोग किया जाता के गोले

सफाई कारतूस धारकों और बैरल liners:

1. प्लेस कारतूस, बैरल liners, और साबुन पानी के साथ एक बीकर में विसारक स्क्रीन
2. स्नान और 20 मिनट के लिए sonicator sonicate में रखें बीकर
3. अच्छी तरह से पानी से कुल्ला जब तक सभी साबुन अवशेषों को हटा रहे हैं
4. एक घंटे के लिए 70% EtOH में लेना
5. सूखी कागज तौलिया पर प्लेस सूखी रातोंरात
6. साफ़ कारतूस, बैरल liners, और स्क्रीन तो बाद biolistic transfections में reused किया जा सकता है

मुसीबत Biolistic अभिकर्मक के लिए शूटिंग युक्तियाँ

Biolistic अभिकर्मक कभी कभी suboptimal अभिकर्मक शर्तों में परिणाम कर सकते हैं . यह भी या कुछ भी कई कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, बहुत अधिक या बहुत कम अभिव्यक्ति के स्तर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या ऊतकों स्लाइस के कारण आम तौर पर अस्वस्थ हो सकता है. अक्सर दबाव विस्फोट से अस्वस्थ स्लाइस परिणाम. यहाँ कुछ सुझाव के लिए बेहतर ट्रांसफ़ेक्ट ऊतक स्लाइस प्राप्त हैं.

यदि स्लाइस अस्वस्थ हो सकता है (या अगर भी कई कोशिकाओं / टुकड़ा ट्रांसफ़ेक्ट हैं) की कोशिश करो, दिखाई देते हैं:

• शूटिंग दूरी में वृद्धि
• गैस की टंकी पर कम दबाव
• सोने की मात्रा कम
• जैव रेड विसारक के केंद्र में कटौती और एक विसारक स्क्रीन के साथ केंद्र की जगह.

यदि भी कुछ कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, की कोशिश:

• शूटिंग दूरी कम
• गैस की टंकी पर बढ़ते दबाव
• सोने की मात्रा में वृद्धि
• ऊतक स्लाइस की संख्या / अच्छी तरह से बढ़ रही
• सुनिश्चित करें कि प्रति बैरल लाइनर में O-अंगूठी बरकरार है.

यदि आप दोनों भी कई और भी कुछ एक ही शूटिंग के दौरान यह सुनिश्चित कर लें ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ स्लाइसें प्राप्त

• है कि आप संतुलित ऊपर अच्छी तरह से बंदूक पकड़ रहे हैं
• कि सोने में समान रूप से कोटिंग टयूबिंग के अंदर. (यदि आप सोने की एक लाइन हो रही है, एक तेज दर पर टयूबिंग से सतह पर तैरनेवाला आकर्षित एक बार सोने बसे है और नाइट्रोजन पर बदल से पहले सोना अब बारी बारी से अगर, दूसरे हाथ पर, आप सोने के streaking हो रही है . इस संभावना बुलेट निर्माण के दौरान बहुत अधिक नमी जोखिम की वजह से है: सुनिश्चित करें कि आप EtOH के एक बंद बोतल का उपयोग कर रहे हैं कि टयूबिंग कोटिंग से पहले अच्छी तरह से सूखा है, और आप lids कैपिंग और एक समय पर ढंग से गोलियों की तैयारी) कि .

यदि अभिकर्मक दक्षता इष्टतम लगता है (# कोशिकाओं / टुकड़ा ट्रांसफ़ेक्ट), लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर को बहुत अधिक या बहुत कम लगता है:

• सोने के अनुपात डीएनए समायोजित करें. (उदाहरण के लिए, अगर यह बहुत कम है सोने की मात्रा को बनाए रखने, लेकिन डीएनए की मात्रा में वृद्धि.)
• शूटिंग और डेटा संग्रह के बीच समय की राशि को समायोजित

दोहरी अभिकर्मक के मामले में, यदि आप अपने constructs की अभिव्यक्ति बहुत कम हो रही है, उचित ढंग से दो constructs के अनुपात को समायोजित और है कि दोनों constructs एक ही प्रमोटर के तहत कर रहे हैं सुनिश्चित करें, ताकि के रूप में यकीन करने के लिए है कि एक प्रमोटर अन्य नहीं बाहर प्रतिस्पर्धा करेंगे.

Discussion

Biolistic अभिकर्मक ऊतक रहने के उच्च वेग डीएनए लेपित सोने के कणों के साथ बमबारी के माध्यम से कोशिकाओं transfecting के एक भौतिक साधन है. कण मध्यस्थता जीन स्थानांतरण में, सामान्य ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में परिणाम जब बुलेट नाभिक में आराम आता है. जबकि कई अलग अलग अभिकर्मक तरीकों मौजूद हैं, microinjection, lipofection, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक electroporation, और वायरल अभिकर्मक के रूप में, biolistic अभिकर्मक एक कम श्रम गहन, कोशिकाओं है कि आसानी से इन अन्य तरीकों का उपयोग नहीं ट्रांसफ़ेक्ट हैं transfecting के लिए और कुशल वैकल्पिक पेशकश कर सकते हैं. वास्तव में, यह पहली बार पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए एक तकनीक के रूप में विकसित किया गया था के बाद सेल की दीवार की उपस्थिति ^{अभिकर्मक} मुश्किल preexisting 1 विधियों का उपयोग. इसी तरह, biolistics तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में लोकप्रियता हासिल की है के बाद के बाद mitotic ^{न्यूरॉन्स} 2,3 transfect बेहद मुश्किल हैं . विशेष रूप में, यह व्यापक रूप से सिद्धांत तकनीक बरकरार मस्तिष्क स्लाइसें में एकल न्यूरॉन्स के ठीक आकारिकी का आकलन करने के उद्देश्य से प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा के रूप में मान्यता प्राप्त है. यहाँ वर्णित तरीकों कैसे सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइसें के biolistic अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए एक जीन बंदूक आयोजित हाथ (जीन Helios गन प्रणाली, जैव रेड) का उपयोग कर के एक विस्तृत और व्यापक विवरण प्रदान करते हैं.

Biolistic अभिकर्मक टुकड़ा संस्कृति में न्यूरॉन्स transfecting के लिए पसंदीदा तरीका बन गया है क्योंकि यह मस्तिष्क टुकड़ा भर में कोशिकाओं का एक विरल संख्या के अभिकर्मक की अनुमति देता है. इस तरह, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अलगाव में जांच की जा सकती है. के बाद से इस तकनीक का विशेष रूप से अच्छी तरह से मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स transfecting के लिए अनुकूल है, यह अक्सर दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में ^{प्रयोग} किया जाता है fluorescently लेबल प्रकाश बिखरने 4 ऊतक के भीतर गहरे कोशिकाओं के 2- photon उत्तेजना सक्षम बनाता है दृश्य के बाद से. दरअसल इस वीडियो भर में एकल पिरामिड प्रस्तुत न्यूरॉन्स के उच्च बढ़ाई छवियों एक कस्टम बनाया लेजर 2-photon खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. निष्कर्ष biolistic अभिकर्मक में चारों ओर की कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के संदर्भ के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं transfecting का एक कारगर साधन है, और fluorescently neuronal टुकड़ा संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए इस तरह के रूप में अत्यंत उपयोगी साबित हो गया है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
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