진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

Summary

우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.

Abstract

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 입자와 조직을 bombarding하여 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 우리는 DNA 코팅 총알의 초기 준비에서 유전자 총을 사용하여 organotypic 슬라이스 문화의 마지막 촬영에, 쥐 hippocampal 조각의 biolistic transfection에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 유전자 총 transfection은 뉴런을 transfecting의 효율적이고 쉬운 방법이며 찬란 조직 통에 세포의 작은 하위 집합을 라벨에 특히 유용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 먼저 DNA와 코팅 골드 입자하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 우리는 옆에있는 골드 / DNA 총알과 플라스틱 튜브의 내부를 선하는 방법을 보여줍니다 및 유전자 총에 로딩을위한 플라스틱 카트리지를 얻으려면이 튜브를 잘라하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 생명 래드 취급을 보여주는 것은 유전자 총을 편, 그리고 건강하고 최적의 transfected 조직 조각을 얻기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공, 쥐 hippocampal 슬라이스 문화 biolistic transfection을 수행합니다.

Protocol

BIOLISTIC TRANSFECTION에 대한 PROTOCOL

총알 만들기

총알은 최대 6 개월 좋다지만, 2~3개월 후 transfection 효율 감소로 시작할 수 있습니다. 글머리 기호는 dessicant 알약의 존재 4 ° C에 저장해야합니다. 항상 병을 열기 전에 실내 온도에 따뜻한 총알이 저장되는 섬광의 튜브를, 보자.

시작하기 전에 준비했습니다 :

• Spermidine (0.05M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100 % - 고급 - 개봉 병)
• Autoclaved H ₂ 0
• transfected 수 DN​​A
• Polyvinylpyrrolidone (PVP - 20 MG / ML 주식)
• 2 X 15 ML 원뿔 (2/bullet 세트)
• 튜브 (X ~ 30인치 / 총알 세트 1로 절단)
• 섬광 튜브 (1/bullet 세트)
• 탈수 알약
• 10 ML 주사기 W / 끝에 튜브

튜빙을 준비 :

1. 드라이 ~ 튜브 역 W / N ₂ 가스 (0.4 압력) 20 분 최소의 튜브 30 인치 (약 2 인치 오른쪽 O - 링 넘어 연장).

골드 비즈 DNA를 Precipitating :

1. microcentrifuge 관 50 μmL 전체 볼륨 (최대 50 μg 총 DNA)에 transfected 수 DN​​A 준비
2. 골드 6-8 MG를 무게와 microcentrifuge 관으로 전송
3. 금을 0.05M spermidine 100 μL를 추가하고 20 초에 대한 sonicate
4. 골드 / spermidine하는 DNA의 50 μL를 추가
5. 와동 (설정 5 정도) W / 캡 오픈
6. 1M CaCl _2의 현명한 100 μL를 드롭 추가
7. Sonicate의 잠시 (<5 초)
8. 온도는 실온에서 10 분 석출물 수 있도록 허용
9. 간략 Sonicate

sonication 동안 PVP 솔루션을 준비 :

1. (3.5 ML 백퍼센트 EtOH로 20mg/ml PVP 주식의 7.5 μL 추가) 총알의 각 집합 15 ML 원뿔, 3.5mL 희석 PVP에서 PVP 솔루션을 희석 확인

EtOH와 골드 비즈를 Rinsing :

1. microcentrifuge 10 초 최고 속도 골드 비즈를 스핀 다운
2. 뜨는 폐기하지만, 황금 구슬 위에 액체의 소량을 유지
3. 필요한 경우 1ml EtOH로 배 세척, 잠시 때마다 sonicate

PVP 솔루션에 Resuspend 골드 / DNA :

1. 3.5 ML 희석 PVP / EtOH 솔루션 200 μL의 황금 펠릿을 Resuspend
2. 소용돌이 resuspend에 금을 펠릿 (필요한 경우 간단히 sonicate)
3. 새로운 15 ML 원뿔에 금색 / PVP 솔루션의 200 μL를 전송
4. 모든 금괴가 15 ML 원뿔로 전송되었습니다 때까지 한 번에 PVP 200 μL를 추가, 이런 방식으로 계속하고, 최종 볼륨 3.2 ML입니다

코팅 튜브 :

1. 튜브 역에서 N _{2를 끄고} 말린 튜브를 제거
2. 10 ML의 주사기에 건조 튜빙을 첨부
3. 목숨 걸고 15 ML 원뿔은 골드 / PVP 가득 흔들
4. 골드 / PVP 솔루션에 튜브의 끝 부분을 넣고 거품을 피하기 위해 천천히되는주의 빨아
5. 튜빙의 양쪽에서 ~ 2인치 건조 남겨주세요
6. 관 여전히 주사기에 부착된과 골드 / PVP 솔루션으로 가득으로 신중하게 튜브를 다시 역에 배치
7. 솔루션 앉아 튜브의 끝을 표시
8. 골드는 주사기가 부착된 5 분 해결하자
9. 해결 골드가 (다시 - 세척해야 않게) 남겨진 있도록 주사기를 당겨 매우 천천히 솔루션을 빨아
10. 주사기를 분리
11. 90 ° 회전 2 초 앉아 보자
12. 180 ° 회전하여 다른 이초 앉아 보자
13. 5 초위한 튜브를 회전
14. 밸브가 0.4 사이 읽는 있도록 N ₂ 켜고 - 0.5 및 5 분 동안 건조 골드 코팅 튜빙을 스핀.

튜빙을 절단 :

1. 튜브의 준비 - 역에서 튜브를 제거하고 상처에서 끝을 잘라.
2. 컷 카트리지를 잡고 튜브 헬기가 아래 표시 섬광의 병을 넣어
3. 플레이스 튜브 헬기에 튜브 깨끗한 면도날로 튜브를 잘라
4. 섬광의 약병에 탈수의 알약을 플레이스
5. 4 스토어 카트리지 ° C

조직 조각 슈팅

교양 조각 촬영 때, 그것은 오염을 방지하기 위해 상대적으로 살균 기술을 채택하는 것이 중요합니다. 두 개의 서로 다른 구조를 촬영하면, 총알이 모두 세트가 동일한 카트리지 홀더에 로드할 수 있지만, 배럴 - 라이너와 화면 구성 사이에서 변경되어야한다고, 기억하십시오.

시작하기 전에 준비했습니다 :

• DNA 총알 (열기 전에 상온에 섬광 약병을 따뜻한하자)
• 조직 조각
• 진 건 헬리 우스
• 유전자 총 호스와 헬륨 탱크 첨부 </ 리>
• 카트리지 홀더
• 대신에 플라스틱과 바렐 라이너는 O - 링
• 디퓨저 (수정)
• 디퓨저 화면
• 집게

유전자 총을 준비 :

1. 사용 포셉는 카트리지 홀더에 금이 코팅된 플라스틱 카트리지를 놓습니다.
2. 첫째 돌려 잠금을 추진하여 유전자 총에 카트리지 홀더 플레이스
3. 자물쇠 카트리지 홀더를 고정
4. O - 링과 장소에 안전하게 디퓨저 화면 배럴의 라이너를 구합니다
5. 유전자 총에 배럴 - 라이너를 스크류

유전자 총을 교양 조각 슈팅 :

1. 귀 muffs 입어
2. 호스 연결 헬륨 가스 탱크에 유전자 총을 플러그
3. 180 PSI에 탱크에 압력을 턴
4. 디퓨저 화면에서 어떤 먼지 또는 파편을 제거하기 위해 공중에 빈 쏴. 총을 쏴하려면 먼저 방아쇠를 당긴다 후, 총 삡까지 안전 잠금 버튼을 우울.
5. 빈 촬영 후 인큐베이터에서 조각을 제거할
6. 첫번째 구축 사전 총
7. 0.5 디퓨저 화면 쏴 - 슬라이스에서 1 인치
8. 우물 사이의 카트리지를 사전.
9. 마지막으로 잘 촬영 후 인큐베이터에 다시 조각 장소
10. 헬륨 호스에서 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다
11. 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지를 제거하고 사용 조개

카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소 :

1. 장소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 비눗물로 비커에 확산 화면
2. 20 분 목욕 sonicator 및 sonicate에 플레이스 비커
3. 모든 비누 잔류물이 제거되기 전까지는 철저히 물을 린스
4. 시간 동안 70 % EtOH에서 소크
5. 건조 건조 종이 타월에 소는 하룻밤
6. 청소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 화면은 다음 후속 biolistic transfections에 활용할 수 있습니다

Biolistic Transfection에 대한 문제 해결 팁

Biolistic transfection 때로는 suboptimal transfection 조건이 발생할 수 있습니다. 너무 적거나 너무 많은 세포가 transfected, 너무 높거나 너무 낮은 표현 수준을 초래할 수도 있고, 일반적으로 건강에 해로운가 될 조직 조각을 일으킬 수 있습니다. 압력 폭발에서 종종 건강에 해로운 슬라이스 결과. 최적 transfected 조직 조각을 얻기 위해 몇 가지 도움말입니다.

: 슬라이스 (또는 너무 많은 세포 / 슬라이스를 transfected 경우), 시도 건강에 해로운 것으로 나타날 경우

• 증가 촬영 거리
• 가스 탱크에 압력 감소
• 골드의 크기를 감소
• 바이오 방사선 디퓨저의 중심을 절단하고 디퓨저 화면 중앙을 대체합니다.

너무 몇 가지 세포가 transfected있다면, 시도 :

• 촬영 거리를 감소
• 가스 탱크에 대한 압력 증가
• 골드의 양을 증가
• / 잘 조직 조각의 수를 증가
• 총신 - 라이너에 O - 링이 그대로 있는지 확인하십시오.

같은 촬영 있는지 확인하는 동안 transfected 모두 너무 많은 너무 몇 가지 세포와 조각을 얻을 경우 :

• 당신은 대칭 위에 잘 총을 들고있다
• 금괴는 균일 튜브의 내부 코팅입니다. (당신은 황금 라인을 받고있다면, 골드가 가라앉을 때 한 번 빠른 속도로 튜브에서 뜨는을 그릴 및 질소를 켜기 전에 금을 더 이상 회전. 반면에, 당신이 금을 줄이을 받고있는 경우, , 이것은 가능성이 총알 제작 중에 너무 많은 수분 노출로 인해됩니다 튜브가 코팅하기 전에 완전히 건조하고 피부를 상한 이상) 적시에 총알을 준비한다는 사실을 당신은 EtOH의 개봉 병을 사용하고 있는지 확인하십시오.

transfection 효율이 최적이 보이는 경우 (# 전지 / 슬라이스를 transfected)하지만, 표현 수준이 너무 높거나 너무 낮은 것 같다 :

• 골드에 대한 비율 DNA를 조정합니다. (너무 낮은 경우 예를 들어, 황금의 크기를 유지하지만, DNA의 양을 증가시킵니다.)
• 촬영 및 데이터 수집 간의 시간을 조정

이중 transfection의 경우에는, 귀하의 구성 중 하나가 너무 작은 표현을 받고있다면, 확인을 줄 수있는만큼, 적절한 방식으로 두 구성의 비율을 조정하고 모두 구조가 동일한 모터 아래에 있는지 확인 이거요 발기인은 다른 밖에서 경쟁하지 않습니다.

Discussion

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 골드 입자 살아있는 조직의 폭격을 통해 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 총알이 핵의 나머지에 관해서는 입자 매개 유전자 전달에는 일반적으로 transfected 세포의 결과. 여러 transfection 방법이 존재하지만, 같은 microinjection, lipofection, 칼슘 인산염 transfection, electroporation 및 바이러스성 transfection으로 biolistic transfection은 쉽게 이러한 다른 방법을 사용하여 transfected되지 않은 세포를 transfecting위한 집중 적은 노동,하고 효율적인 대안을 제공할 수 있습니다. 세포 벽의 존재는 전부터 방법 ^1을 사용 transfection이 어려운 만든 이후 사실, 처음 식물의 유전자 전달을위한 기술로 개발되었습니다. 포스트 mitotic의 뉴런은 ^2,3를 transfect하는 악명 어려운되므로 마찬가지로, biolistics는 신경 생물학 분야에서 인기를 얻고있다. 특히, 그것은 널리 그대로 뇌 조각의 단일 뉴런의 벌금 형태를 평가하기위한 실험에 사용할 수있는 주요 기술로 인식되고 있습니다. 방법은 유전자 총을 개최 손 (; 바이오 래드 편 진 건 시스템)을 사용하여 양식 뇌 조각의 biolistic transfection을 수행하는 방법에 대한 상세하고 포괄적인 설명을 제공합니다 여기에서 설명한.

그것은 뇌 슬라이스에 걸쳐 세포의 스파스 번호 transfection을 허용하기 때문에 Biolistic transfection은 슬라이스 문화에 신경을 transfecting에 대한 기본 방법이되었다. 이러한 방법으로 각각의 뉴런은 격리 검사하실 수 있습니다. 이 기법은 특히 뇌 슬라이스의 뉴런을 transfecting 적합되기 때문에, 그것은 종종 광 산란 조직 ^네 안에 깊은 찬란 분류 세포의 2 광자 여기있게 시각화 이후, 2 광자 현미경과 함께 사용됩니다. 사실이 동영상을 통해 제공 하나 피라미드 뉴런의 높은 배율 이미지는 사용자 지정 기본 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 점령했다. 결론 biolistic transfection 주변 세포가 높은 밀도의 컨텍스트 내에서 개별 세포를 transfecting의 효율적인 수단이며, 같은 찬란의 연결을 슬라이스 문화에서 개별 뉴런을 라벨에 대한 매우 유용한 입증되었습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).