Подготовка генной пушки Маркеры и Biolistic Трансфекция Нейроны фрагмент культуры

Summary

Мы опишем способ получения ДНК пулями золота и продемонстрировать использование таких пуль biolistically трансфекции нейронов гиппокампа в культуре ломтиками.

Abstract

Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток бомбардирующих ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые. Мы предоставляем подробные протокол для biolistic трансфекции срезах гиппокампа крыс, от первоначальной подготовке ДНК пулями в финал съемки органотипической культур ломтик использованием генной пушки. Трансфекции генов пушка является эффективным и простым средством трансфекции нейронов и особенно полезен для флуоресцентной маркировки небольшая часть клеток в тканях кусочек. В этом видео, мы первые наброски шагов, необходимых, чтобы покрыть частицы золота с ДНК. Далее показано, как линия внутри пластиковой трубкой с золотом / ДНК пули, и как разрубить этот трубопровод для получения пластиковых картриджей для загрузки в генной пушки. Наконец, мы выполняем biolistic трансфекции гиппокампа крыс культур срез, демонстрирующий обработку Bio-Rad Гелиос генной пушки и предложение консультаций устранения неисправностей для получения здоровых и оптимально трансфицированных ломтиками ткани.

Protocol

ПРОТОКОЛ BIOLISTIC трансфекции

Создание пуль

Пули хороши на срок до 6 месяцев, но может начать снижение эффективности трансфекции через 2-3 месяца. Пули должны храниться при температуре 4 ° С в присутствии осушителем гранул. Всегда давайте сцинтилляционные флаконы, в которых пули хранятся, нагреться до комнатной температуры перед открытием флакона.

Прежде, чем начать есть готовые:

• Спермидина (0,05 М)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100%-высокий класс-закрытой бутылке)
• Автоклавного H ₂ 0
• ДНК для трансфекции
• Поливинилпирролидон (ПВП-20 мг / мл акций)
• 2 X 15 мл конические (2/bullet комплект)
• Трубка (сокращение в 1 X ~ 30 дюймов / пуля комплект)
• Сцинтилляционных флаконов (1/bullet комплект)
• Сушка гранул
• 10 мл шприца ж / трубкой на конце

Подготовка трубки:

1. Сухой ~ 30 дюймов труб (около 2 дюймов, выходящие за право уплотнительное кольцо) в трубы станции ж / N ₂ газа (0,4 давления) в течение минимум 20 мин.

Осаждения ДНК на золото бисера:

1. Подготовка ДНК для трансфекции в 50 μmL общего объема в микроцентрифужных трубку (не более 50 мкг тотальной ДНК)
2. Взвесьте из 6-8 мг золота и трансфер в микроцентрифужных трубки
3. Добавить 100 мкл 0,05 М спермидина на золото и разрушать ультразвуком в течение 20 сек
4. Добавить 50 мкл ДНК, чтобы золото / спермидина
5. Vortex (около настройки 5) ж / крышка открыты
6. Добавить падение мудрых 100 мкл 1М CaCl ₂
7. Разрушать ультразвуком кратко (<5 сек)
8. Разрешить для осаждения в течение 10 мин при комнатной температуре
9. Разрушать ультразвуком кратко

Подготовка ПВП раствора во время обработки ультразвуком:

1. Сделать разбавленный раствор ПВП в 15 мл конические, 3.5mL разбавленный ПВП для каждого набора пули (добавить 7,5 мкл фондовом 20mg/ml ПВП до 3,5 мл 100% этанола)

Промывка золотым бисером с этанолом:

1. Спином вниз золотым бисером на полной скорости в течение 10 сек в микроцентрифужных
2. Удалите надосадочную, но держать небольшое количество жидкости в верхней части золотым бисером
3. Вымойте 3X с 1 мл этанола, разрушать ультразвуком кратко каждый раз, в случае необходимости

Ресуспендируют золото / ДНК в растворе ПВП:

1. Ресуспендируют золотые гранулы в 200 мкл 3,5 мл разбавленного PVP / EtOH решение
2. Vortex золотых гранул для ресуспендирования (кратко разрушать ультразвуком при необходимости)
3. Передача 200 мкл золото / ПВП решение новых 15 мл коническую
4. Продолжайте таким образом, добавив 200 мкл ПВП в то время, пока все золото было передано 15 мл конические, и окончательный объем составляет 3,2 мл

Покрытие трубки:

1. Выключите № ₂ на станции трубки и удалить сухой трубы
2. Прикрепить сушеные трубку к 10 мл шприца
3. Энергично встряхните 15 мл конические с золотом / ПВП
4. Поместите конец трубки в золоте / ПВП решение и сосать медленно будьте осторожны, чтобы избежать пузырей
5. Оставьте ~ 2 дюйма сухой с обоих концов трубы
6. С трубкой еще привязаны к шприц и заполненный решение золото / ПВП, осторожно поместите трубку обратно в станцию
7. Марк концы трубки, где сидит решение
8. Пусть золото урегулировать в течение 5 мин с шприц прилагается
9. Подлиза решение очень медленно, потянув шприц так, чтобы установившееся золото остается позади (убедитесь, что не обратно стирки)
10. Отсоедините шприц
11. Повернуть на 90 ° и пусть сидят в 2 секунды
12. Поворот на 180 ° и пусть сидят еще 2 секунды
13. Поверните трубку на 5 секунд
14. Включите N _2, так что клапан читает между 0,4 - 0,5 и спина с золотым покрытием трубки во время сушки в течение 5 мин.

Резка трубы:

1. Снимите трубку от трубки приготовительные-станции и отсек заканчивается знаками.
2. Положите помечены сцинтилляционный флакон под трубы вертолета поймать сократить картриджи
3. Место трубки в трубку вертолет и вырезать трубки с чистой бритвой
4. Место высыхания гранул в сцинтилляционный флакон
5. Магазин картриджей при 4 ° С

Съемки срезы тканей

При съемке культурный ломтиками, важно использовать относительно стерильной техники для того, чтобы избежать загрязнения. Помните, что при съемке двух различных конструкций, оба набора пули могут быть загружены в тот же держатель картриджа, но ствол-вкладыш и экран должен быть изменен между конструкциями.

Прежде, чем начать есть готовые:

• ДНК пули (пусть сцинтилляционный флакон нагреться до комнатной температуры перед открытием)
• Срезы тканей
• Helios генной пушки
• Гелий бак с генной пушки шланг прилагается </ LI>
• Картридж держатель
• Ствол лайнер с пластиковым кольцом на месте
• Диффузор (модифицированный)
• Диффузор экрана
• Щипцы

Prepping генной пушки:

1. Использование щипцов место золота покрытые пластиковой картриджей в держатель картриджа.
2. Место держатель фильтра в генной пушки, сначала отодвинув блокировки
3. Закрепите держатель фильтра с замком
4. Получить баррель лайнер с уплотнительным кольцом и диффузор экран надежно в месте
5. Винт баррель-лайнер в генной пушки

Съемки культурных срезов генной пушки:

1. Наденьте наушники
2. Подключите гена пистолет в бак шланг подключен газ гелий
3. Поднимите давление в баке до 180 PSI
4. Стреляйте пустое в воздух, чтобы удалить пыль и мусор с диффузором экране. Стрелять пушка, во-первых нажмите кнопку блокировки, пока пистолет гудки, а затем нажать на курок.
5. После съемки пустой, удалить ломтики из инкубатора
6. Advance пистолет сначала построим
7. Съемка с диффузором экрана около 0,5 - 1 см от среза
8. Advance картридж между скважинами.
9. После съемок последнего хорошо, место ломтики обратно в инкубатор
10. Выключите газ и сброса давления перед отсоединением пистолет из гелия шланга
11. Отвинтите баррель лайнера, и удалите картридж и использовать снаряды

Чистящий картридж владельцев и ствол лайнеров:

1. Место патронов, ствол лайнеры, и диффузор экраны в стакан с мыльной водой
2. Место стакан в sonicator ванны и разрушать ультразвуком в течение 20 минут
3. Тщательно смойте водой, пока все остатки мыла удаляются
4. Замочите в 70% этаноле в течение часа
5. Место на сухое бумажное полотенце на ночь для сухой
6. Чистая патронов, ствол лайнеры, и экраны могут быть повторно использованы в последующих biolistic трансфекции

Устранение неисправностей советы для Biolistic Трансфекция

Biolistic трансфекции иногда может привести к нерациональному условия трансфекции. Это может привести к слишком мало или слишком много клеток, трансфицированных, слишком высокий или слишком низкий уровень экспрессии, или может причинить срезы тканей, чтобы стать вообще вредно для здоровья. Часто результатом нездоровой ломтики от давления взрыва. Вот некоторые подсказки, чтобы получить оптимально трансфицированных ломтиками ткани.

Если ломтики кажутся нездоровыми (или, если слишком много клетки трансфицированных / срез), попробуйте:

• увеличение расстояния съемки
• уменьшая давление на топливном баке
• уменьшении количества золота
• вырезания центр Bio-Rad диффузор и замена центр с диффузором экране.

Если слишком мало клетки трансфицированных, попробуйте:

• уменьшение расстояния съемки
• все большее давление на топливном баке
• увеличение количества золота
• увеличение числа срезы тканей / а
• убедитесь, что уплотнительное кольцо в стволе-лайнер не поврежден.

Если вы получаете ломтики с обеих слишком много и слишком мало клеток, трансфицированных за тот же съемки убедитесь, что:

• что вы держите в руках пистолет симметрично выше хорошо
• , что золото является равномерное покрытие внутри трубы. (Если вы получаете линии золота, вытянуть супернатант из трубы более быстрыми темпами, как только золота осела и вращать золота больше, прежде чем включить азота. Если, с другой стороны, вы получаете полос золота , это, вероятно, из-за слишком много влаги во время воздействия пули решений: убедитесь, что вы используете закрытой бутылке EtOH, что трубка полностью высохнуть перед нанесением покрытия, и что вы укупорки крышек и подготовке пуль своевременно).

Если эффективность трансфекции кажется оптимальной (# клеток, трансфицированных / срез), но уровень экспрессии кажется слишком высокой или слишком низкой:

• настроить соотношение ДНК к золоту. (Например, если оно слишком низкое поддерживать количество золота, но увеличить количество ДНК.)
• регулировать количество времени между съемкой и сбора данных

В случае двойного трансфекции, если вы получаете слишком мало выражению одного из ваших конструкций, настроить соотношение двух конструкций в надлежащей форме и убедиться, что обе конструкции под тем же промоутер, с тем чтобы убедиться, что одна Промоутер не будет из-конкурировать с другом.

Discussion

Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток с помощью бомбардировки живой ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые золотом. В частиц опосредованного переноса генов, в общем-трансфицированных клеток результат, когда пуля приходит в состояние покоя в ядре. Хотя много различных методов трансфекции существуют, например, микроинъекции, липофекция, кальций-фосфат трансфекции, электропорации и вирусной трансфекции, biolistic трансфекции может предложить менее трудоемким и эффективной альтернативой для трансфекции клеток, которые не так легко трансфекции с помощью других методов. На самом деле, он был впервые разработан в качестве методики переноса генов в растениях так как наличие клеточной стенки сделаны трансфекции трудно использованием существующего метода ^1. Точно так же biolistics приобрел популярность в области нейробиологии с пост-митотического нейронов, которые заведомо трудно трансфекции ^2,3. В частности, она широко известна как принцип техники, которые будут использоваться в экспериментах, направленных на оценку тонкой морфологии отдельных нейронов в интактных ломтики мозга. Методы, описанные здесь, обеспечивают детальное и всестороннее объяснение, как выполнить biolistic трансфекции культурный ломтики мозга с помощью ручных генной пушки (Helios генной пушки системы; Bio-Rad).

Biolistic трансфекции стала предпочтительным методом трансфекции нейронов в срез культуры, поскольку она позволяет трансфекции редкими количество клеток по всему мозгу срез. Таким образом, отдельные нейроны могут рассматриваться в изоляции. Так как этот метод особенно хорошо подходит для трансфекции нейронов в мозге ломтик, он часто используется в сочетании с 2-фотонной микроскопии, так как 2-фотонного возбуждения позволяет визуализацию флуоресцентно меченых клеток глубоко внутри ткани рассеяния света ^4. Действительно изображения с высоким увеличением одного пирамидных нейронов, представленные в этом видео были получены с помощью пользовательских построен 2-фотона лазерного сканирующего микроскопа. В заключение biolistic трансфекции является эффективным средством трансфекции отдельных клеток в контексте высокой плотностью окружающих клеток, и как таковое оказалось чрезвычайно полезным для флуоресцентной маркировки отдельных нейронов в нейронной культуры срез.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).