Beredning av Bullets Gene Gun och Biolistic transfektion av nervceller i Slice Kultur

Summary

Vi beskriver en metod för att förbereda DNA-belagda guld kulor och demonstrera användningen av sådana kulor till biolistically transfektera nervceller i odlade hippocampus skivor.

Abstract

Biolistic transfektion är en fysisk form av transfecting celler genom att bombardera vävnad med hög belagda hastighet DNA-partiklar. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll för biolistic transfektion av råtta hippocampus skivor, från den ursprungliga beredningen av DNA-belagda kulor till den slutliga inspelningen av organotypic skiva kulturerna med en gen pistol. Gene pistol transfektion är ett effektivt och enkelt sätt att transfecting nervceller och är speciellt användbar för fluorescerande märkning en liten delmängd av celler i vävnaden skiva. I denna video, disposition vi först de åtgärder som krävs för att partiklar päls guld med DNA. Vi visar bredvid hur man klär insidan av plaströr med guld / DNA kulor, och hur man kan minska denna slang för att få plast patroner för påfyllning av genen pistol. Slutligen utför vi biolistic transfektion av råtta hippocampus skiva kulturer, visar hantering av Bio-Rad Helios genen pistol, och ge råd felsökning för att få friska och optimalt transfekterade vävnad skivor.

Protocol

PROTOKOLL FÖR BIOLISTIC transfektion

Göra kulor

Punkter är bra för upp till 6 månader, men kan börja minska i transfektion effektivitet efter 2-3 månader. Kulor ska förvaras vid 4 ° C i närvaro av torkmedel pellets. Låt alltid skintillationsflaskor, där kulor lagras, värmas upp till rumstemperatur innan du öppnar flaskan.

Innan du börjar ha klart:

• Spermidine (0,05)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100%-högvärdigt-oöppnad flaska)
• Autoklaveras H ₂ 0
• DNA ska transfekterade
• Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml lager)
• 2 x 15 ml koniska (2/bullet set)
• Slangar (skuren i 1 X ~ 30 inches / bullet set)
• Skintillationsflaskor (1/bullet set)
• Uttorkning pellets
• 10 ml spruta w / slang på änden

Förbered slang:

1. Torr ~ 30 inches av slang (ca 2 inches längre än rätt O-ring) i slangen stationen W / N _2-gas (0,4 tryck) i minst 20 min.

Utlösande DNA på guld pärlor:

1. Förbered DNA ska transfekterade i 50 μmL totala volymen i mikrocentrifugrör (max 50 mikrogram totala DNA)
2. Väg upp 6-8 mg guld och överföring till ett mikrocentrifugrör
3. Tillsätt 100 mikroliter av 0,05 spermidine guld och Sonikera 20 sek
4. Tillsätt 50 mikroliter av DNA till guld / spermidine
5. Vortex (ca inställning 5) w / cap öppen
6. Tillsätt droppvis 100 mikroliter 1 M CaCl ₂
7. Sonikera kort (<5 sek)
8. Låt utfällning pågå i 10 minuter vid rumstemperatur
9. Sonikera kort

Förbered PVP lösning under sonication:

1. Gör späda PVP-lösning i 15 ml koniska, 3.5ml späd PVP för varje uppsättning av kulor (lägg till 7,5 mikroliter av 20mg/ml PVP lager till 3,5 ml 100% EtOH)

Sköljning guld pärlor med EtOH:

1. Spinn ner guld pärlor i full fart i 10 sek i mikrocentrifug
2. Kassera supernatanten, men behålla en liten mängd vätska på toppen av guld pärlor
3. Tvätta 3X med 1 ml EtOH, låt ligga en kort stund varje gång om det behövs

Resuspendera guld / DNA i PVP lösning:

1. Resuspendera guld pelleten i 200 mikroliter av 3,5 ml utspädd PVP / EtOH lösning
2. Vortex guldet pelleten resuspendera (kort Sonikera om nödvändigt)
3. Överför 200 mikroliter av guld / PVP lösning på ett nytt 15 ml konisk
4. Fortsätt på detta sätt lägga till 200 mikroliter av PVP i taget tills allt guld har överförts till de 15 ml koniska, och den slutliga volymen är 3,2 ml

Beläggning slang:

1. Stäng av N ₂ i slangen stationen och ta bort torkade slangar
2. Fäst torkade slangar till 10 ml sprutan
3. Skaka 15 ml koniska fylld med guld / PVP
4. Placera änden av slangen i guld / PVP lösning och suga upp långsamt noga med att undvika bubblor
5. Lämna ~ 2 inches torra från båda ändarna av slangen
6. Med slangen fortfarande sitter spruta och fylld med guld / PVP lösning, försiktigt placera slangen tillbaka till stationen
7. Markera ändarna av slangen där lösningen sitter
8. Låt det guld nöjer 5 min med sprutan fäst
9. Sug upp lösningen mycket långsamt genom att dra i sprutan så att den fasta guld är kvar (se till att inte back-tvätt)
10. Koppla sprutan
11. Rotera 90 ° och låt sitta i 2 sekunder
12. Rotera 180 ° och låt sitta ytterligare 2 sekunder
13. Rotera röret i 5 sek
14. Slå på _N-2 så att ventilen läser på 0,4 - 0,5 och snurra på guld-belagda rör medan torkning i 5 min.

Kapning slang:

1. Ta bort slangen från slangen prep-stationen och klipp av ändarna på märken.
2. Sätt en märkt scintillation flaska under slangen helikoptern för att fånga skära patroner
3. Placera slangen i slangen helikoptern och skär slangen med rent rakblad
4. Placera en uttorkning pellets i scintillations injektionsflaska
5. Förvara patronerna vid 4 ° C

Skytte Tissue Slices

När du fotograferar odlade skivor, är det viktigt att anställa en relativt steril teknik för att undvika kontaminering. Kom ihåg, att när du fotograferar två olika konstruktioner, kan båda kulorna laddas in i samma patronhållaren, men fat-liner och skärmen ska bytas mellan konstruktioner.

Innan du börjar ha klart:

• DNA-kulor (låt scintillation injektionsflaska värmas upp till rumstemperatur innan den öppnas)
• Tissue skivor
• Helios Gene Gun
• Helium tank med genen pistol slang fäst </ Li>
• Patronhållaren
• Barrel liner med plast O-ring på plats
• Diffusor (modifierad)
• Diffuser Skärm
• Tång

Prepping genen pistol:

1. Använd pincett placera guld belagd plast patroner i patronhållaren.
2. Placera filterhållaren i genen pistolen genom att först trycka tillbaka låset
3. Säkra patronhållaren med lås
4. Skaffa en tunna liner med en O-ring och spridaren skärmen säkert på plats
5. Skruva fast fat-liner i genen pistol

Fotografera odlade skivor med genen pistol:

1. Sätt på hörselkåpor
2. Anslut genen pistol i slang ansluten Helium bensintank
3. Höj trycket på tanken till 180 PSI
4. Skjut en tomt i luften för att avlägsna damm och skräp från spridaren skärmen. Att skjuta pistol, först tryck säkerheten förregling knappen tills pistolen piper, sedan trycka av.
5. När du filmat det tomma, ta bort skivor från inkubatorn
6. Advance pistol att först konstruera
7. Skjut med diffusor skärmen ca 0,5 - 1 tum från segmentet
8. Advance patronen mellan brunnar.
9. När du filmat det sista väl, placera skivor tillbaka in i inkubatorn
10. Stäng av gasen och släpper trycket Innan du tar bort pistolen från Helium slangen
11. Skruva loss fat liner, och ta bort kassetten och använda skal

Rengöringskassett ägare och trosskydd fat:

1. Placera patroner, liners fat, och skärmar diffusor i en bägare med tvålvatten
2. Placera bägaren i badet sonicator och Sonikera 20 min
3. Skölj med vatten tills alla tvålrester avlägsnas
4. Blötlägg i 70% EtOH i en timme
5. Placera på torr pappershandduk över natten för att torka
6. Rengör bläckpatroner, liners fat, och skärmar kan sedan återanvändas i senare biolistic transfections

Felsökning tips för Biolistic Transfektion

Biolistic transfektion kan ibland resultera i suboptimalt transfektion förhållanden. Det kan leda till för få eller för många celler transfekterade, för högt eller för lågt uttryck eller kan orsaka vävnad skivor bli allmänt ohälsosamt. Ofta ohälsosamma skivor resultat från trycket explosionen. Här är några tips för att få optimalt transfekterade vävnad skivor.

Om skivor verkar vara ohälsosam (eller om alltför många celler transfekterade / skiva), försök:

• ökar fotograferingsavstånd
• minskar trycket på bensintank
• minska mängden guld
• klippa ut i mitten av Bio-Rad diffusor och ersätta centrum med en diffusor skärm.

Om för få celler transfekterade, försök:

• minskar fotograferingsavstånd
• ökande trycket på bensintank
• att öka mängden guld
• öka antalet vävnaden skivor / brunn
• Se till att O-ringen i tunnan-liner är intakt.

Om du får skivor med både för många och för få celler transfekterade under samma skytte se:

• att du håller pistolen symmetriskt placerad ovanför väl
• att guld är jämnt beläggning på insidan av slangen. (Om du får en linje av guld, dra ut supernatant från slangen i en snabbare takt efter att guldet har lagt sig och rotera guldet längre innan du sätter på kväve. Om, å andra sidan, får ni strimmor av guld Detta beror troligen på för mycket fukt exponering under bullet göra: Se till att du använder en oöppnad flaska EtOH, att slangen är ordentligt torr innan beläggningen, och att du tak lock och förbereder kulor i rätt tid).

Om transfektion effektivitet verkar optimal (# celler transfekterade / skiva), men uttrycket nivån verkar för hög eller för låg:

• anpassa förhållandet DNA till guld. (T.ex. om det är för lågt behålla mängden guld, men öka mängden DNA.)
• justera tiden mellan fotografering och datainsamling

Vid dubbla transfektion, om du får för lite uttryck för en av dina konstruktioner, justera förhållandet mellan de två konstruktioner på ett lämpligt sätt och se till att båda konstruktioner är under samma promotorn, så se till att en promotor kommer inte konkurrera ut den andra.

Discussion

Biolistic transfektion är en fysisk form av transfecting cellerna via bombardemang av levande vävnad med hög belagda hastighet DNA-guld partiklar. I partikel medierad genöverföring i allmänhet transfekterade celler resultat när kulan stannar i cellkärnan. Medan många olika transfektion metoder finns, såsom mikroinjektion, lipofection, kalcium-fosfat transfektion, elektroporation och virala transfektion, kan biolistic transfektion erbjuda en mindre arbetsintensiv och effektiva alternativ för transfecting celler som inte är lätt transfekterade med hjälp av dessa andra metoder. I själva verket var det först utvecklades som en teknik för genöverföring i växter eftersom närvaro av cellväggen gjorde transfektion svårt att använda redan existerande metoder ^1. Likaså har biolistics vunnit popularitet inom neurobiologi sedan efter mitotiska nervceller är notoriskt svåra att transfektera ^2,3. Framför allt är det allmänt erkänt som den princip som skall användas i experiment för att bedöma fina morfologi hos enskilda nervceller i hjärnan intakt skivor. De metoder som beskrivs här ger en detaljerad och omfattande beskrivning av hur man utför biolistic transfektion av odlade hjärnan skivor med hjälp av en handhållen gen-gun (Helios Gene Gun systemet, Bio-Rad).

Biolistic transfektion har blivit den bästa metoden för transfecting nervceller i slice kulturen eftersom den tillåter transfektion av en gles antal celler i hela hjärnan slice. På detta sätt kan enskilda nervceller granskas isolerat. Eftersom den här tekniken är särskilt väl lämpad för transfecting nervceller i hjärnan skiva, är det ofta används i samband med 2-foton mikroskopi, eftersom 2-photon excitation möjliggör visualisering av fluorescerande celler djupt inom ljusspridning vävnad ^4. Faktum är att hög förstoring bilder av enstaka pyramidal nervceller som presenteras i den här videon fångades med hjälp av en specialbyggd 2-foton laserskanning mikroskop. Sammanfattningsvis biolistic transfektion är ett effektivt sätt att transfecting enskilda celler i samband med en hög täthet av omgivande celler, och som sådan har visat sig extremt användbart för fluorescerande märkning enskilda nervceller i neuronala bit kultur.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).