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Biology

만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

doi: 10.3791/680 Published: February 15, 2008

Summary

이 비디오 및 프로토콜은 설치류에 유리 커버 두개골 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이러한 준비는 생체내 개월 시간 단위 동안 네크로 텍스의 2 광자 이미징에서 만성 사용할 수 있습니다. 그것은 광학 내장 신호 이미징을 포함한 이미징의 다른 유형에도 사용할 수 있습니다.

Abstract

이미징 기술이 연구의 뇌 기능에 점차 중요 해지고 있습니다. 그것이 사는 그대로 두뇌의 연구를 수 있기 때문에 그 중에서도 두 광자 레이저 스캐닝 현미경은 매우 유용한 방법으로 떠오르고있다. 적절한 준비와 함께,이 기술은 몇 분 거리 개월, 만성 같은 피질 영역의 관찰하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 준비를 보여줍니다. 이 기술은 처음에는 지금 Janelia 팜에서 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다 박사 카렐 스보로 개척되었다. 여기에 표시된 것과 같은 준비가 이미지 대뇌 피질의 혈류 역학에, 칼슘에 민감한 염료를 사용하여, 또는 내장 광학 이미징 연구의 연결 활동을 기록하는 neocortical 구조 (예, 돌기 및 axonal 역학)의 영상에 사용될 수 있습니다. 네크로 텍스의 깊은 영상은 최적의 두개골 창 수술 가능합니다. 수술하는 동안 두라 메이터을 손상하지에 극단주의를 사용하여 함께, 감염을 피하기 위해 가능한 한 가장 멸균 조건 하에서 운영, 성공적이고 지속적인 유리 덮인 두개골 Windows에서 발생합니다.

Protocol

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  1. IACUC 승인 절차를 사용하여 isoflurane와 쥐 (유도 4 %, 수술을 1.5-2 %)을 마취. 꼬리 및 / 또는 발가락 핀치스이 동물이 완전히 진정되도록하기 위해 사용하는 것이 중요합니다.
  2. 쥐 트리머를 사용하여, 최대 눈 목 뒤쪽에서 머리를 면도.
  3. 수술 물을 다시 순환 담요 이상 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 단단히 귀에 바와 함께 머리를 확보.
  4. 밖으로 건조에서 동물의 눈에을 방지하기 위해, 눈 연고를 적용합니다.
  5. Dexamethasone (0.2 밀리그램 / 킬로그램)와 Carprofen가 (5 밀리그램 / 킬로그램) 각각의 뇌 및 / 또는 염증 반응의 붓기 방지하기 위해, subcutaneously, 관리할 수 있습니다.
  6. 수술을 시작하기 전에 70 % 알코올 및 betadine 세 교대 swipes와 함께 피부를 닦는하여 운영 지역을 소독.
  7. 모든 수술기구는 유리 비드 살균기를 사용하여 사전에 소독하고 있습니다. 에탄올로 소독되었습니다 가위를 사용하여 살다가 두 주동이의 방향으로 상처 거의 눈꺼풀에 도달, 두 경사 상처 뒤에있는 모든 머리의 기본을 따라 수평 절단, 시작, 두개골의 맨 위에 피부를 제거 그것은 정중선에서 수렴.
  8. lidocaine + 에피네프린 솔루션의 한 방울이 과도한 출혈이나 통증을 피하기 위해 골막에이 시점에서 적용됩니다. 메스로 두개골의 가장자리에 골막을 철회. 또한, 가볍게 목 뒤쪽의 근육을 철회.
  9. 부드럽게 마른 표면을 만들기 위해 메스로 두개골의 전체 노출 영역을 다쳤어요. 나중에 적용할 때 접착제가 잘 준수 수 있듯이 매우 중요합니다.
  10. 이미징 사이트가 선택되면, 하나는 두개골 창을 만들 준비가되어 있습니다. 첫째, 부드럽게 공압 치과 드릴 직경 약 4 mm의 원형 "을 그려."
  11. 약간 드릴링 후, 두개골 표면에 다시 lidocaine + 에피네프린 솔루션을 적용할 수 있습니다. 뼈의 매우 얇은 층이 남아있는 책임이 중지합니다. 이 방법을 제공하는 방법 느낄 수 craniotomy의 중앙에 부드럽게 밀어 하나는 일반적으로이 단계에 도달 알고 있습니다.
  12. 뼈 해면 구조 - - 뼈 trabeculae의 생리와 복용의 이점을 한 방울에 따라 매우 얇은 팁 포셉와 두개골에서 craniotomy 멀리 리프트. 그것은 두개골을 들어올려하고 두라의 출혈을 방지하므로 생리가 중요합니다.
  13. 이전에 두개골이 제거되었을 때 가끔 발생하는 작은 출혈을 멈추게하는 두라 메이터에 호수에 배어있다 Gelfoam을 적용합니다.
  14. 두라 메이터 표면을 건조되며 출혈이 없다는 것을 확인한 후, 부드럽게 두라 메이터 위에 멸균 5mm 유리 커버 슬립을 믿는다. (참고 : 다른 그룹도 두라 이상 낮은 용융 점 아가로 오스 (1.2 %)의 드롭을 배치하고 한천 위에 coverslip을 넣어.)
  15. 두개골에 반대 반구에 cyanocrylate 기반 접착제 한 방울을 적용합니다. 조심하는 것이 유리 밑에 넣고되지 동안 바늘의 도움으로, 부드럽게 모든 창 주변의 접착제를 적용합니다. 접착제 이제 두개골의 전체 표면 위에 얇은 레이어에 적용할 수 있습니다.
  16. 접착제가 건조되면, 그것을 보장하기 위해서, 또한 커버 슬립의 작은 림을 포함, 두개골 표면에 걸쳐 치과 아크릴을 혼합하고 그것을 적용해야합니다.
  17. 커버 슬립을 확보 후, 치과 아크릴과 창문 주위에 작은 우물을합니다. 또한, 치과 아크릴에 티타늄 막대를 삽입할 수 있습니다. 이 막대는 나중에 영상을위한 현미경의 무대에 안전하게 마우스를 첨부하는 데 사용됩니다. 그것은 두개골 창은 병렬가되도록, 바가 수준 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 막대 아래에 종이를 게재하면 아크릴은 견고하면서 막대가 수준 유지하도록 할 수 있습니다.
  18. 치과 아크릴은 10 분 (강화) 치료 허용, 어떤 시점에 티타늄 막대 제자리에 고정합니다. 그것이 복구까지 따뜻한 새장에 동물을 배치합니다.
  19. 마취에서 회복 후, 동물은 당일 몇 군데하실 수 있습니다.

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Discussion

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우리가 비디오에서 두 광자 현미경의 사용과 결합하여 보조 수치, 두개골 윈도우 준비에 나타난 것처럼, 생체내 네크로 텍스의 구조와 기능에서 공부하는 매우 강력한 도구입니다. 기술 관련 해부학 및 미세 수술 절차 및이 준비가 필요 기술에 익숙해지로 엄격한 훈련이 필요합니다. 단지 깨끗한 수술은 만성 이미징 사용할 수 있습니다. 두라이 과도하거나 구멍을 조작하면, 준비는 이미지에 사용해서는 안됩니다.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Carprofen (Rimadyl) Drug Pfizer Pharma GmbH
Isoflurane (Aerrane) Surgery Baxter Internationl Inc.
Dexamethasone Drug Baxter Internationl Inc.
Ortho-Jet Powder Reagent LANG To be mixed with the acrylic
Jet-Acrylic Liquid Reagent LANG To be mixed with Ortho-Jet Powder
Round Glass Cover Slip Tool Electron Microscopy Sciences 72195-05 5 mm diameter
Gelfoam Surgery Pharmacia Corporation (Pfizer)
Titanium bars are custom-made

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References

  1. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
  2. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
  3. Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
  5. Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).More

Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680, doi:10.3791/680 (2008).

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