Summary
Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.
Abstract
Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können. Die Methode besteht in der Implantation eines Schädel-Bildgebung Fenster Injektion einer fluoreszierenden Kalzium-Indikator-Farbstoff, die sich durch eine große Anzahl von Neuronen genommen werden kann und schließlich die Aufnahme der Aktivität von Neuronen mit Zeitraffer-Kalzium-Imaging mit einem in-vivo Zwei-Photonen-Mikroskop. Co-Injektion von Astrozyten-spezifische Farbstoffe ermöglicht es, Neuronen aus Astrozyten differenzieren. Die Technik kann in Mäusen, die fluoreszierende Moleküle in bestimmten Subpopulationen von Neuronen zum besseren Verständnis der Netzwerk-Interaktionen der verschiedenen Gruppen von Zellen durchgeführt werden.
Protocol
- Bereiten Sie die fluoreszierenden Kalzium-Indikator-Lösung. Wir verwenden Acetoxymethylester Farb-oder AM Farbstoffe für kurze. Dies sind Farbstoffe, die von den Zellen aufgenommen werden können, wenn sie injiziert extrazellulär. Wir verwenden in der Regel Oregon-Green BAPTA-1 AM-oder Fluo-4 AM in einer Konzentration von 1 mM. AM Farbstoffe können von Invitrogen in 50 Mikrogramm Fläschchen erhältlich. Wir bereiten Sie zunächst eine 20% ige Lösung von Pluronic F-127 in DMSO. Wir erwärmen die Lösung vor Gebrauch jeden Tag bis zu seiner klar. Wir lösen das Kalzium-Indikator von 20% Pluronic F-127/DMSO für 15-20 Minuten zu einer Konzentration von 10 mM. Wir haben dann verdünnt die Lösung auf 1mm in einer Lösung mit, in mM: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 Hepes, pH 7,4. Darüber hinaus ist 100 uM Sulforhodamin 101 meist Label Astrozyten enthalten und visualisieren Sie die Pipette während der Injektion. Wir filtern die Lösung vor der Injektion mit einem 0,49 Mikron Zentrifugalfilter (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
- Implant ein Schädel-Fenster über den Bereich abgebildet werden. Wir haben den allgemeinen Ansatz in JoVE beschrieben , aber die folgenden Änderungen sind für Calcium-Farbstoff Injektion wichtig:
Machen Sie eine kleine Kraniotomie von 2 mm Durchmesser in den kortikalen Bereich des Interesses, wobei äußerste Sorgfalt nicht auf die zugrunde liegende Dura Schäden. Sichere einem Deckglas in Ort über die Kraniotomie, aber nur teilweise decken die Kraniotomie, noch ein kleiner Spalt zwischen dem Rand der Kraniotomie und das Deckglas, um Platz für eine Pipette zum Kortex schräg geben können. Vor der Injektion, machen Sie eine flache Wanne mit Zahnzement rund um die Kraniotomie. Das sollte gut zu verlängern, als rostral in Richtung und flach genug, um das Einführen der Mikropipette für die Injektion zu ermöglichen. - Übertragen Sie die Maus übertragen auf die Bühne des Mikroskops und Immobilisierung des Kopfes, wie in unserem gezeigt video auf den Blutfluss Bildgebung .
- Pull Glas-Mikroelektrode Pipetten zu einem Spitzendurchmesser Nachgeben 2-4 Mega Ohm im Widerstand, mit einer Pipette Abzieher. Laden Sie die Kalzium-Indikator-Farbstoff-Mix auf der Glaspipette mit einer Mikroliterspritze. Mit einem Mikromanipulator, sanft niedriger der Mikropipette auf die Oberfläche des Gehirns mit einem 4X Ziel, die dann fein ist unter einem 40X-Objektiv positioniert. Wählen Sie einen geeigneten Standort für die Injektion, so dass es nur wenige oder gar keine darüber liegenden Blutgefäße zur Bildgebung im Dunkeln. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die Spitze der Pipette visualisiert und ging langsam in die Rinde, bis zu einer Tiefe von 200 Mikrometern unterhalb der Dura. Dann spritzen Druck der Farbstoff-Gemisch bei 10 PSI für 1 Minute mit einem Picospritzer. Wir liefern in der Regel zwei vor vier Injektionen des AM Calcium-Farbstoff-Mix, im Raum von etwa 200-300 Mikrometer voneinander getrennt. Diese Schüttgutfrachtraum Ansatz leicht überlappenden Injektionen sorgt dafür, dass eine Fläche so groß wie 600 x 600 Mikrometer ausreichend ist für Kalzium-Imaging gefärbt. Begin Bildgebung 1 Stunde nach der Injektion des AM Farbstoffmischung, um den Farbstoff zu verbreiten und sich von den Neuronen aufgenommen werden können.
- Führen Sie in-vivo Zwei-Photonen-Imaging mit einer custom made Zwei-Photonen-Mikroskop mit einer Chameleon Ti-Saphir-Laser (abgestimmt auf 800-880 nm) und Cambridge Technology Galvanometerspiegeln. Wir erwerben von Bildern mit scanimage Software in Karel Svoboda Labor (Pologruto et al., 2003) entwickelt. Laser Power ist in der Regel deutlich unter 70 mW an der Probe. Gesamten Bereich Bilder erworben werden entweder mit einem 20fach (0,95 NA) oder 40X (0,8 NA) Olympus Ziele, bei 1,95-15,63 Frames pro Sekunde (512 x 256 Pixel bis 256 x 64 Pixel). Line-Scans bei 500 Hz erworben. Während der Aufnahme werden die Tiere unter leichtem Isofluran-Narkose (0,6-0,9%) gehalten werden, und sind auch bei 37 ° C mit einem Harvard Apparatus Temperature Control Device. Es wird darauf geachtet, die Atemfrequenz der Tiere so nah zu 100 Atemzüge / Minute wie möglich zu halten. Dieses Maß an Betäubung ist die unterste Ebene, dass das Tier bewegungsunfähig, aber immer noch erlaubt spontane Aktivität aufgezeichnet werden.
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Discussion
Der Vorteil dieser Methode gegenüber elektrophysiologischen Ableitungen ist, dass sie weniger invasiv ist und erlaubt die Aufnahmen der Aktivität in neuronalen dichten neuronalen Netzen. Wenn Sie dieses Verfahren es ist wichtig, daran zu erinnern, extreme Vorsicht beim Ausführen der Kraniotomie nicht auf die Dauer beschädigen. Schon eine kleine Menge von subduralen Blutungen mit stark hinwegtäuschen Bildgebung.
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Acknowledgments
Wir möchten Olga Garaschuk für hilfreiche Diskussionen zur Optimierung der Bulk-Loading von Kalzium-Indikatoren bestätigen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
