Summary
Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.
Abstract
Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução. O método consiste na implantação de uma janela de imagem do crânio, a injeção de um corante indicador fluorescente de cálcio que podem ser tomadas por um grande número de neurônios e, finalmente, gravar a atividade dos neurônios com o tempo de imagem usando um lapso de cálcio in-vivo duas microscópio de fótons. Co-injeção de astrócitos específicos corantes permite diferenciar os neurônios de astrócitos. A técnica pode ser realizada em camundongos expressando moléculas fluorescentes em subpopulações específicas de neurônios para entender melhor as interações de rede de diferentes grupos de células.
Protocol
- Prepare a solução indicador fluorescente de cálcio. Nós usamos corantes éster acetoxymethyl, ou AM corantes para breve. Estes são corantes que podem ser absorvidas pelas células quando injetado extracelularmente. Normalmente usamos Oregon-Green-BAPTA 01:00 ou 04:00 Fluo-a uma concentração de 1 mM. Corantes AM podem ser obtidas Invitrogen em frascos de 50 microgramas. Primeiro, preparar uma solução de 20% dos PLURONIC F-127 em DMSO. Nós aquecer a solução antes de usar todos os dias até a sua clara. Nós dissolver o indicador de cálcio F-127/DMSO PLURONIC 20% por 15-20 minutos a uma concentração de 10 mM. Em seguida, diluir a solução de 1mM em uma solução contendo, em mM: NaCl 150, KCl 2,5, 10 Hepes, pH 7.4. Além disso, 100 Sulforhodamine M 101 é normalmente incluído para astrócitos rótulo e visualize a pipeta durante a injecção. Nós filtrar a solução antes da injeção com um filtro de 0,49 micron centrífuga (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
- Implante uma janela cranial sobre a área a ser trabalhada. Temos descreveu a abordagem geral em JOVE , mas as seguintes modificações são importantes para a injeção de corante de cálcio:
Fazer uma pequena craniotomia de 2 mm de diâmetro sobre a área cortical de interesse, tomando extremo cuidado para não danificar a dura-máter subjacente. Garantir uma lamela no lugar sobre a craniotomia, mas apenas parcialmente cobrir a craniotomia, deixando um pequeno espaço entre a borda da craniotomia e da lamela de vidro para permitir espaço para uma pipeta para entrar no córtex obliquamente. Antes da injeção, faça um buraco raso com cimento dental ao redor do craniotomia. O bem deve estender-se em direção rostral e ser rasa o suficiente para permitir a inserção da micropipeta de injeção. - Transferir o mouse transferido para o estágio do microscópio e imobilizar a cabeça, como mostra a nossa imagem de vídeo no fluxo sanguíneo .
- Puxe pipetas de vidro de microeletrodos para um diâmetro da ponta rendendo 2-4 Ohms mega na resistência, usando um extrator pipeta. Carregar o mix de cálcio corante indicador para a pipeta de vidro, utilizando uma micro. Usando um micromanipulador, delicadamente abaixar a micropipeta sobre a superfície do cérebro usando uma objetiva de 4X, que é então finamente posicionado sob objetiva de 40X. Escolha um local adequado para injeção, de tal forma que existem vasos sobrejacente poucos ou nenhum sangue para obscurecer a imagem. Utilizando dois fótons de microscopia, a ponta da pipeta é visualizado e avançado lentamente no córtex, a uma profundidade de 200 micrômetros abaixo da dura-máter. Então, a pressão de injetar a mistura de corante em 10 PSI por 1 minuto usando um Picospritzer. Costumamos oferecer 2-4 injeções da mistura de corante de cálcio AM, separados no espaço por cerca de 200-300 microns. Esta abordagem carregamento a granel de injeções ligeiramente sobrepostos garante que uma área tão grande como 600 x 600 mícrons é adequadamente manchada para imagens de cálcio. Começar uma hora de imagens após a injeção da mistura de corante AM, para permitir o corante para difundir e ser absorvido pelos neurônios.
- Realizar in-vivo de dois fótons de imagem com um custom made microscópio de dois fotões utilizando um Chameleon Ti-Safira Laser (ajustado para 800-880 nm) e espelhos galvanômetro Cambridge Technology. Nós adquirir imagens utilizando Software scanimage desenvolvido em laboratório Karel Svoboda do (Pologruto et al., 2003). Potência do laser é tipicamente bem abaixo de 70 mW na amostra. Imagens campo inteiro são adquiridos utilizando uma 20X (0,95 NA) ou 40x (0.8 NA) objetivos Olympus, no 1,95-15,63 frames por segundo (512 x 256 pixels para 256 x 64 pixels). Varreduras de linha são adquiridas a 500 Hz. Durante a gravação, os animais são mantidos sob anestesia com isoflurano luz (0,6-0,9%), e também são mantidos a 37 ° C usando um aparelho de Harvard dispositivo de controle de temperatura. Cuidado é tomado para manter a freqüência respiratória dos animais, enquanto cerca de 100 respirações / minuto possível. Este nível de uso de anestesia é o nível mais baixo que imobiliza o animal, mas ainda permite a atividade espontânea a ser gravado.
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Discussion
A vantagem deste método sobre gravações eletrofisiológicas é que é menos invasiva e permite que as gravações da atividade neuronal em densas redes neuronais. Ao fazer este procedimento é importante lembrar de tomar extremo cuidado ao realizar a craniotomia para não danificar a dura. Mesmo uma pequena quantidade de sangramento subdural com muito obscura a imagem.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Olga Garaschuk para discussões úteis sobre como otimizar o carregamento a granel de indicadores de cálcio.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
