Summary
Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.
Abstract
Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem. Bu yöntem, çok sayıda nöron tarafından alınan ve son olarak in vivo iki foton mikroskop kullanarak zaman atlamalı kalsiyum görüntüleme ile nöron aktivitesini kayıt olabilir floresan kalsiyum göstergesi boya enjekte kraniyal görüntüleme penceresi implante oluşur. Astrosit özel boyalar ko-enjeksiyon astrositler gelen nöronların ayırt etmek sağlar. Bu teknik, farelerde farklı hücre grupları ağ etkileşimi daha iyi anlamak için, nöron spesifik alt popülasyonlar floresan moleküller ifade yapılabilir.
Protocol
- Floresan kalsiyum indikatör çözeltisi hazırlayın. Biz kısa boyalar acetoxymethyl ester boyaların kullanımı, veya AM. Bunlar ekstraselüler enjekte edilen hücreler tarafından alınabilir boyalar. Biz genellikle 1 mM konsantrasyonda Oregon-Yeşil BAPTA 01:00 AM Fluo-4 kullanın. AM boyalar 50 mikrogram flakonlarda Invitrogen elde edilebilir. Biz ilk DMSO F-127 Pluronic% 20'lik bir çözelti hazırlamak. Biz temizleyene kadar her gün kullanmak için önce çözüm sıcak. Biz kalsiyum göstergesi 10 mM konsantrasyon 15-20 dakika için% 20 Pluronic F-127/DMSO çözülür. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, pH 7.4: Daha sonra mM içeren bir çözüm, çözüm için 1mm sulandırmak. Buna ek olarak, 100 mcM Sulforhodamine 101 genellikle etiket astrositler dahil edilir ve enjeksiyon sırasında pipet görselleştirmek. Biz 0.49 mikron santrifüj filtre (; Garaschuk ve ark, 2006 Stosiek ve ark, 2003) ile enjeksiyon için önce çözüm filtresi.
- Görüntülenecek alana bir kafatası pencere İmplant. Biz vallahi de genel yaklaşım tarif , ancak aşağıdaki değişiklikler kalsiyum boya enjeksiyon için önemlidir:
Altta yatan dura zarar vermemek için aşırı özen, ilgi kortikal alana çapı 2 mm daha küçük bir kraniotomi olun. Kraniotomi üzerinde bir yerde lamel Güvenli, ama sadece kısmen korteks oblik girmek için bir pipet için oda izin kraniotomi kenarında ve cam lamel arasında küçük bir boşluk bırakarak, kraniotomi kapsayacak. Enjeksiyonu öncesinde, kraniotomi etrafında diş çimento ile sığ bir kuyu. Iyi yönde rostral genişletmek ve enjeksiyon için mikropipet ekleme yetecek kadar sığ olmalıdır. - Mikroskop aşamasında transfer fare transferi ve bizim gösterildiği gibi, baş hareketsiz kan akışını görüntülemede video .
- 2-4 Mega Ohm direnç veren bir pipet çektirmenin kullanarak, bir ucu çapı, cam mikroelektrot pipetler çekin. Yük, bir mikroenjektör kullanarak cam pipet üzerine kalsiyum göstergesi boya karışımı. Bir mikromanipülatör kullanarak, sonra ince bir 40X amaç altında konumlandırılmış 4X objektif kullanarak beynin yüzeyine hafifçe mikropipet düşüktür. Görüntüleme gizlemek için az ya da hiç örten kan damarları olduğu gibi enjeksiyon için uygun bir yer seçin. Iki foton mikroskobu kullanarak, pipet ucu, dura altında 200 mikrometre arasında bir derinliğe kadar görüntülenebilmekte ve korteks yavaş yavaş içine gelişmiş. Sonra, basınç, Picospritzer kullanarak 1 dakika için 10 PSI boya karışımı enjekte edilir. Biz genellikle yaklaşık 200-300 mikron uzayda ayrılmış 03:58 AM kalsiyum boya karışımı enjeksiyon, sağlar. Toplu yükleme biraz üst üste enjeksiyonları Bu yaklaşım, 600 x 600 mikrona kadar büyük bir alan, yeterince kalsiyum görüntüleme için boyanmış olmasını sağlar. Diffüz ve nöronlar tarafından alınacak boya için izin vermek için, 1 saat sonra görüntüleme AM boya karışımı enjeksiyon başlayın.
- In vivo iki foton özel bir görüntüleme Chameleon Ti-Safir Lazer (800-880 nm ayarlı) ve Cambridge Teknoloji galvanometre aynalar kullanılarak yapılan iki foton mikroskop gerçekleştirin. Karel Svoboda laboratuarı (Pologruto ve ark, 2003) geliştirilen ScanImage Yazılımı kullanarak görüntü kazanır. Lazer Gücü genellikle iyi örnek az 70 mW altında. Tüm alanında görüntüler ya saniyede 1,95-15,63 kare (256 x 64 piksel 512 x 256 piksel) 20X (0.95 NA) veya 40X (0.8 NA) Olympus hedefleri kullanarak elde edilir. Hat taramaları 500 Hz elde edilir. Görüntüleme sırasında, hayvanlar, hafif izofluran anestezi altında (0.6-0.9%) tutulur ve ayrıca 37 tutulur ° C Harvard Aparatı Sıcaklık Kontrol Cihazı kullanarak. Bakım hayvanların solunum hızı 100 soluk / dk mümkün olduğunca yakın olarak tutmak için alınır. Bu seviye, anestezi kullanımı, hayvan durduran en düşük seviyede, ama yine de kayıt altına spontan aktivite izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin avantajı, elektrofizyolojik kayıtlar üzerinde daha az invaziv ve yoğun nöron nöron ağları faaliyet kayıtları izin vermesidir. Bu işlemi yaparken kraniotomi yaparken dura zarar vermemek için aşırı dikkat çekmek için hatırlamak önemlidir. Subdural kanama bile küçük bir miktar büyük ölçüde görüntüleme belirsiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz kalsiyum göstergelerin toplu yükleme optimize yararlı tartışmalar için Olga Garaschuk kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
