Summary
新しい幹細胞療法の評価のためにそれはin vivoで注入された細胞を非侵襲的に追跡することが重要です。このビデオでは、生体内でのその後のMRイメージングのための生体内で酸化鉄ベースの造影剤によるヒト間葉や胚性幹細胞を標識する方法を紹介します。
Abstract
近年では、幹細胞研究、発生生物学、様々な疾患と再生医療への影響の可能性についてのより良い理解につながっている。生体内で何度も移植された幹細胞を監視する非侵襲的方法は非常に我々の能力のメカニズムを制御する幹細胞の死を理解し、幹細胞の生着を向上させる栄養因子とシグナル伝達経路を特定するためにを高めるであろう。 MR画像は、近くに微細な解剖学的分解能を持つ幹細胞のin vivo描写のための効果的なツールであることが証明されています。 MRで幹細胞を検出するためには、細胞が細胞特異的MRの造影剤で標識する必要があります。この目的のために、このような超常磁性酸化鉄粒子（SPIO）のような酸化鉄ナノ粒子は、、のための細胞の検出とその優れた生体適合性のための彼らの高感度で、適用されます。 SPIO粒子は酸化鉄のコアとT2強調MR画像上で減少信号を発生するローカルフィールドの不均一性を、作成することによって、デキストラン、carboxydextranまたは澱粉コート、および関数で構成されています。このプレゼンテーションでは、MRイメージングと標識された細胞の生体内追跡、その後の非侵襲的に臨床的に適用可能なMR造影剤と幹細胞の標識のためのテクニックのデモンストレーションを行います。
Protocol
FerucarbotranとhMSCのラベリング
これはFerucarbotran、MRイメージングのための酸化鉄ベースの造影剤でヒト間葉系幹細胞を標識するためのテクニックです。
- 開始するには、プレート18〜24時間、80％の合流点でT75フラスコ中のラベリング手順の前に細胞。別の培養皿を使用する場合、これは1cm 2当たり約10000細胞に等しくなります。
- 翌日、無血清培地8mlをするResovistの30μlを添加してラベリングメディアの準備から始まります。これは100μgのFe / mlの培地の濃度に対応する、80％コンフルエントに一つT75フラスコにラベルを付けます。
- 培地を外し、PBSまたは無血清培地で細胞を1回洗浄する。これは、残留血清タンパク質と造影剤と影響力の標識効率を結合することができるメディアの他の成分を取り除くために行われます。
- フラスコにラベルメディアを追加し、インキュベーターにフラスコを戻す。
- 2時間後、20％FCSの最終濃度が達成されるように、FCSの2ミリリットルを追加します。これは、細胞が分化して刺激を受けていないことを保証するために行われますが、代わりに使い慣れた環境で成長しています。
- 18時間にわたって細胞をインキュベートする。これは最高の一晩に行われます。
- 翌日、PBSで細胞を洗い流した後、それらをいつものようにトリプシン処理。
- 一度トリプシン、細胞懸濁液は、メディア内の残留、フリー造影剤を取り除くために3回洗浄する必要があります。これは、PBSで5分間で400 rcfで、細胞を遠心分離することで行われます。
- 最終的に細胞ペレットを再懸濁し、さらなる実験のために準備ができます。
- 一部は前の洗浄ステップの間に失われた可能性があるとして、現在のセルを数える。また、トリパンブルー排除アッセイを使用して、この時点で実行可能性のテストを実行し、標識効率を測定する分光分析のためにいくつかのサンプルを取る。
Ferumoxidesでヒト胚性幹細胞の標識
- 開始するには、プレート10cmの皿でヒトES細胞、いつものように。これらの料理は、ゼラチンをプレコートされ、それらの上に照射したフィーダー細胞を持っている。あなたにもフィーダーフリーの培養のためにこのプロトコルを使用することができます。
- 彼らは中規模のコロニーを形成するようにヒトES細胞をアタッチし、約3-4日間に成長しましょう。この時間の間に、コロニーが大きいコロニーは後で分割することがより困難であるとして、大規模に成長していないことを確認してください。
- 分化した細胞は、そのコロニーの清浄度に応じて、これらの培養物を汚染することができます、あなたは、解剖によって差別化された文化を取り除くために必要があります。
- 100μg/mlと完全なhESCのメディアの濃度でFerumoxidesから成るラベル、メディアを準備します。このため、我々は、89μlFerumoxidesと完全増殖培地10mlを混ぜる。
- 完全なメディアで一度皿を洗ってください。
- 皿あたりのメディアのラベル付けの10 mlを添加し、4時間細胞をインキュベートする。
- 今、ラベルは完了です。次のステップでは、細胞を洗浄し、さらに使用するために、単一の細胞懸濁液を得ることが必要です。この場合、最初のPBSで皿を洗う。
- その後、0.25％トリプシン5mlのでPBSを交換し、5分間インキュベーター内でインキュベートする、または細胞がデタッチされるまで。それは頻繁に料理をタップするのに役立ちます。
- セルは切り離されている。料理は大きなコロニーが含まれていると残って塊があるかもしれないことに留意してください。
- これらの塊を取り除くために、いずれかの血清学的ピペットを使用して一度全部停止を混在させることができる、それは別の2分間放置します。
- 我々は、細胞膜を破ることができる細いチップを通して、細胞のように繰り返し吸引をエッペンドルフピペットを使用しないでください。
- 残留塊が存在する場合、一つは40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を実行することができます。
- すべてが正しく機能する場合、単一の細胞懸濁液はゼラチンコーティング、ESC -行列と死細胞に由来する、破片の多くと混合されている存在。このを取り除くために、5分間、400 rcfで、それらをスピンダウンして細胞を2回洗浄し、完全なメディアで再懸濁します。
- 今、ESCは照射フィーダー細胞から分離する必要があります。これは、ゼラチンコートしたディッシュに細胞懸濁液をめっきすることによって効率的に行うことができます。
- 料理が操作されていない場合は、すべての細胞が堆積物下になりますが、フィーダーはESCより速くアタッチされます。
- フィーダは主に料理に添付する必要がある一方そう、上清を45分後に撮影されている場合、それは、主にESCが含まれている必要があります。
- この方法では、さらなる実験のために使用することができる磁気標識されたヒト胚性幹細胞の単一細胞の懸濁液が得られる。
- 以前のプロトコルと同様に、この時点では、セルをカウントし、ラベリング効率の実現可能性評価と測定用サンプルを採取する必要があります。
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Discussion
幹細胞の非侵襲的な描写は、ほぼすべての幹細胞ベースの治療を監視するために重要です。標識された幹細胞のin vivo動態ののより良い理解は、のようなMR画像上で可視化、合理的に方法および幹細胞ベースの治療をより効果的に使用する可能性があります。我々は臨床的に適用される造影剤とイメージング技術を使用しているため、私たちの提示プロトコルは、患者のアプリケーションに簡単に翻訳する必要があります。我々の方法の潜在的な臨床応用は、様々な幹細胞のサブタイプまたは遺伝子改変幹細胞だけでなく、幹細胞移植の予後に関する治療効果の評価の生着過程の比較研究が含まれています。結果は、臨床の現場でそれらの幹細胞ベースの治療の評価において、後に関連する臨床試験のデザインで、幹ベースの治療の前臨床評価ですぐに役立つこと、としてください。注目すべきは、私たちのイメージング技術はまた、造血幹細胞や神経幹細胞などの他の幹細胞集団に適用可能である。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、再生医療のためのカリフォルニア工科大学からレオンJ.タールのSEEDの助成金によってサポートされていました。トビアスヘニングは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/1-2）から奨学金研究によって資金を供給された。我々は感謝してヒト胚性幹細胞の培養上彼のアドバイスをファニートのMenesesを確認応答したい。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
