Summary
וידאו זה מציג טכניקות תיוג של אדם בתאי גזע עובריים ותאי גזע mesenchymal עם צבעי ניאון. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo מעקב בתאי גזע המושתלים עם הדמיה אופטית עבור מתאמים histopathological עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
דימות אופטי (OI) היא כלי קל, מהיר וזול עבור ניטור vivo של טיפולים בתאי גזע חדש מבוסס. הטכניקה מבוססת על תיוג vivo לשעבר בתאי גזע עם פלורסנט לצבוע, הזרקה תוך ורידית הבאים של התאים שכותרתו ויזואליזציה של הצטברות שלהם אברי המטרה או פתולוגיות ספציפיות. הטכניקה הציג מדגים כיצד אנו תווית אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) הדגירה על ידי פשוט עם צבע פלואורסצנטי lipophilic האם (C67H103CIN2O3S) ואיך אנחנו תווית אנושי לתאי גזע עובריים (hESC) עם ה-FDA אישר צבע פלואורסצנטי Indocyanine גרין (ICG). מנגנון ספיגת היא דרך הדבקות ואת דיפוזיה של צבען lypophilic ברחבי bilayer קרום התא פוספוליפידים. יעילות תיוג משופר בדרך כלל אם התאים מודגרת עם הצבע בסרום ללא מדיה להבדיל הדגירה בנסיוב המכיל התקשורת. יתר על כן, תוספת של סולפט סוכן transfection protamine משפר משמעותית את ספיגת חומר ניגוד.
Protocol
תיוג של בתאי גזע mesenchymal עם צבע פלואורסצנטי האם
- כדי להתחיל את הליך תיוג בתאי גזע mesenchymal, trypsinize ולספור את התאים כדי לקבל השעיה עם מספר מוגדר של תאים.
- קח את התאים מתוך החממה לשאוב את התקשורת הישנה של צלוחיות המכילות את התאים להיות מתויג
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של Mg / Ca ללא PBS. לשאוב את PBS. מ"ג ו Ca היה לעכב את טריפסין, ולכן אנו משתמשים PBS בלי אלה.
- הוסף טרום חימם טריפסין 0.05%, עבור בקבוק T75 נשתמש 5 מ"ל. ודא כי כל שטח הבקבוק מכוסה.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה כ -5 דקות.
- אשר את ניתוק מתחת למיקרוסקופ. אם התאים עדיין דבקים הבקבוק, הקש את זה כמה פעמים ולחכות עוד קצת עד trypsinization הוא מוצלח.
- כעת, יש צורך לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיה FCS המכיל 10%. אנו משתמשים מידה שווה של התקשורת כפי שיש טריפסין.
- פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים על מנת להבטיח כי כל התאים מחדש מושעה בתקשורת.
- מעבירים את פתרון התא צינור פוליפרופילן 15 מ"ל סטרילי כתרים.
- צנטריפוגה ב RCF 400 במשך 5 דקות.
- לשאוב את supernatant הבטחת לא להפריע תא גלולה.
- Resuspend התאים DMEM וכדי להמשיך לספור את התא.
- להשעות את התאים להיות מתויג בצפיפות של 1x10 ^ 6 מ"ל לכל במדיום סרום ללא תרבות (DMEM).
- זה היה כל הכנה של השעיה התא. עכשיו, הוא מוכן להתחיל את התוויות.
- ראשית, להוסיף 5 μL של חומר ניגוד האם לכל מ"ל של השעיה התא.
- לאחר מכן, לערבב בעדינות את הפתרון על ידי pipetting.
- דגירה התאים עם פתרון תיוג על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בכלי התקשרות נמוך-6-היטב.
- לאחר דגירה הפשוטה היא מלאה, יש צורך להעביר את פתרון התא צינור פוליפרופילן כתרים 15 מ"ל.
- צנטריפוגה זה למטה RCF 400 במשך 5 דקות.
- לשאוב את המדיום תיוג, כדי להבטיח שלא להפריע תא גלולה.
- לשטוף את התאים עם PBS. פיפטה התאים מעלה ומטה, כדי לוודא לפרק את התא גלולה.
- חזור על שני השלבים האחרונים עוד פעמיים, כך שיש סך של 3 שלבים כביסה.
- ספירת התאים ולבצע בדיקה כחול Trypan לקבוע כדאיות התא. אלה מקובלים תרבית תאים פרוטוקולים שאנו לא הולך להסביר כאן.
- התאים שלך מוכנים כעת להיות הדמיה imager אופטי.
תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים עם ICG את צבע פלואורסצנטי
- כדי להתחיל את הליך תיוג בתאי גזע עובריים אנושיים, להכין את חומר ניגוד Indocyanine הירוק. מערבבים אותו עם protamine הסוכן transfection.
- מדוד את 1mg של אבקת Indocyanine הירוק. ממיסים את אבקת ICG ב 100 μL של Sulfoxide דימתיל (DMSO).
- הוספת 400 μL של השתנה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM + עגל עוברית 10% סרום) מדיה לתערובת ולנער אותו היטב. התוצאה היא ריכוז סופי של 2mg/ml של Indocyanine הירוק.
- מוסיפים את protamine סוכן transfection. מעשים protamine כמו מעבורת עבור הסוכן לעומת זאת, כך שהוא מקבל לתוך התא בצורה יעילה יותר.
- מערבבים 5 סולפט protamine μL, אשר סיפקה בריכוז של 10mg/ml, עם ICG 300 ו - 300 μL השתנה μL בסרום חינם של Dulbecco בינוני הנשרים.
- נער בעדינות את הפתרון transfection חדש למשך 5 דקות כדי לאפשר מורכבים הטופס.
- הפתרון תיוג מוכן.
- לשאוב את התקשורת הישנה של צלחת פטרי hESC 10mm.
- הוסף 5 מ"ל של טרום חימם סרום ללא DMEM.
- מוסיפים את פתרון protamine / ICG מוכן בעבר את התאים. הפעל את הדגירה 1 שעה על ידי הנחת צלחת באינקובטור ב 37 ° C.
- לאחר דגירה תושלם, להסיר את צלחת מן החממה לשאוב את הפתרון תיוג.
- לשטוף את התאים על ידי שטיפת צלחת עם 5 מ"ל PBS.
- לשאוב את PBS ולהחליף עם 5 מ"ל של טריפסין 0.25%. דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר trypsinization להתרחש. זה עוזר לנער את המנה קצת מדי פעם.
- פיפטה בעדינות מעלה ומטה, כדי לשבור את המושבות שנותרו.
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת סכום השווה ל KSR של המנה.
- מעבירים את פתרון התא שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגות הפתרון ב RCF 400 במשך 5 דקות.
- Resuspend התאים התקשורת מלאה.
- אם עדיין יש גושים בשלב זה, trypsinize ו צנטריפוגות שוב.
- פעם גוש ללא פתרון תא מושגת, לשאוב את המדיה הישנה resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של טרום חימם בתקשורת מלא ESC.
- בשלב זה, יש צורך להפריד את העכבר מזין תאים hESCs. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי, מאוחר יותר, רק בתאי גזע הדמיה מתרחשת.
- לשם כך, העברת הדואר פתרון התא צלחת מצופה ג'לטין 10 ס"מ.
- שים את המנה לתוך 37 ° C חממה ולתת לו לשבת במשך 45 דקות. במהלך תקופה זו, ודא שלא להפריע את המנה. עכשיו, ניזונים תדבק המנה ואת בתאי גזע לא.
- מעבירים את הפתרון מתוך צלחת פטרי. ועכשיו יש לנו פתרון אחד של תאים שכותרתו בתאי גזע עובריים אנושיים.
- התאים כעת ניתן לספור ובדיקת כחול Trypan ניתן לבצע אותם.
- התאים מוכנים להיות צילמו!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הו, היא טכניקת דימות חדשה יחסית, מבוססת על זיהוי של הקרינה. הו, הוא רגיש כמו radiotracer מבוססי טכניקות הדמיה, אך לא קשורה לחשיפה בכל הקרנה. הו, מספק אמצעי יעיל של תאים מעקב פולשני ו שוב ושוב, ובכך לספק תובנה נדידת תאים לאתר היעד. מגבלה אחת גדולה של הטכניקה היא חדירה לרקמות מוגבל של בדיקות ניאון in vivo. לכן, הצטברות נותב ברקמות עמוקות יותר על 50-10 ס"מ מעל פני העור, לא ניתן לזהות. יישומים קליניים נוכחי מוגבלים טכניקות שטחיות כגון הדמיה אנדוסקופית, לב וכלי דם רשתיות (Funovics et al. 2003) אבל זה תחום של מחקר תמשיך להרחיב באמצעות הכרה של האפשרויות העצום שמציעה במעקב תא vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי מענק ג'יי טל! SEED ליאון ממכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית. טוביאס הנינג המחקר מומן על ידי מענק מן האגודה הגרמנית למחקר (DFG, HE 4578/1-2). אנחנו רוצים להכיר תודה Meneses חואניטו את עצתו על תרבות בתאי גזע עובריים אנושיים.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
