Summary
Denna video visar tekniker för märkning av mänskliga embryonala stamceller och mesenkymala stamceller med fluorescerande färger. Denna teknik kan användas för en in vivo-spårning av transplanterade stamceller med optisk avbildning och för histopatologisk samband med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Optisk avbildning (OI) är ett enkelt, snabbt och billigt verktyg för in vivo-övervakning av nya baserade stamcellsterapi. Tekniken bygger på ex vivo märkning av stamceller med en fluorescerande färg, därefter intravenös injektion av de märkta cellerna och visualisering av deras ackumulering i specifika målorgan eller sjukdomar. De presenterade tekniken visar hur vi märker mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) genom en enkel inkubering med lipofila fluorescerande färg gjorde (C67H103CIN2O3S) och hur vi märker mänskliga embryonala stamceller (hESC) med FDA godkända fluorescerande färg indocyaningrönt (ICG). Upptaget mekanismen är via vidhäftning och spridning av lypophilic färgämnet över fosfolipid cellmembranet tvåskiktsmembran. Märkningen effektiviteten är oftast bättre om cellerna inkuberas med färgen i serum-fria medier i motsats till inkubation i serum innehållande media. Dessutom förbättras tillägg av transfektion agenten protaminsulfat signifikant upptag kontrastmedel.
Protocol
Märkning av mesenkymala stamceller med fluorescerande färg DiD
- Till att börja proceduren för märkning av mesenkymala stamceller, trypsinize och räkna cellerna för att få en suspension med ett definierat antal celler.
- Ta cellerna ur kuvösen och aspirera ut gamla media från flaskor som innehåller de celler som ska märkas
- Tvätta cellerna med 10 ml Mg / Ca-fri PBS. Sug ut PBS. Den Mg och Ca skulle hindra trypsin, därför använder vi PBS utan dessa.
- Lägg förvärmda 0,05% trypsin, för en T75 kolv vi använder 5ml. Se till att hela ytan i kolven är täckt.
- Inkubera vid 37 ° C i inkubatorn i cirka 5 minuter.
- Bekräfta lossnar under mikroskop. Om cellerna fortfarande hålla sig till kolven trycker den några gånger och vänta lite längre tills trypsinization lyckas.
- Nu är det nödvändigt att neutralisera Trypsin genom att lägga till media som innehåller 10% FCS. Vi använder lika mycket av media som det finns Trypsin.
- Pipettera upp och ner några gånger för att se till att alla celler resuspenderas i media.
- Överför cellen lösningen till en steril 15ml tak polypropylen rör.
- Centrifugera vid 400 RCF i 5 minuter.
- Sug upp supernatanten säkerställer att inte störa cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i DMEM och fortsätt med celltal.
- Häng celler som skall märkas vid en densitet av 1x10 ^ 6 per ml i serum-fri odlingssubstrat (DMEM).
- Detta var alla förberedelser av cellsuspensionen. Nu är den färdig att starta märkning.
- Lägg först till 5 mikroliter av DiD kontrastmedel per ml cellsuspension.
- Sedan blandas lösningen genom att försiktigt pipettera.
- Inkubera cellerna med märkningen lösning vid 37 ° C i 20 minuter i en 6-väl låg infästning skålen.
- När den enkla inkubationen är klar, är det nödvändigt att överföra cellen lösning till en 15 ml tak polypropylen rör.
- Centrifugera ner vid 400 RCF i 5 minuter.
- Sug ut märkning medium, se till att inte störa cellpelleten.
- Tvätta cellerna med PBS. Pipettera cellerna upp och ner, och se till att bryta upp cellpelleten.
- Upprepa de två senare stegen två gånger, så det finns totalt 3 tvätt steg.
- Räkna celler och utföra en Trypan blå test för att fastställa cellviabiliteten. Dessa är standard cellodling protokoll som vi inte kommer att förklara här.
- Dina celler är nu redo att avbildas i optiska kameran.
Märkning av mänskliga embryonala stamceller med fluorescerande färg ICG
- Till att börja proceduren för märkning av mänskliga embryonala stamceller, förbereda kontrastmedlet indocyaningrönt. Blanda det med transfektion agenten protamin.
- Mät upp 1 mg av indocyaningrönt pulver. Lös upp ICG pulver i 100 mikroliter av dimetylsulfoxid (DMSO).
- Tillsätt 400 mikroliter av Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM + 10% fetalt kalvserum) media till blandningen och skaka den väl. Detta resulterar i en slutlig koncentration av 2mg/ml av indocyaningrönt.
- Lägg till Protamin transfektion agent. Protamin fungerar som en skyttel för kontrastmedel, så att den kommer in i cellen mer effektivt.
- Blanda 5 mikroliter protaminsulfat, som tillförs vid en koncentration av 10mg/ml, med 300 mikroliter ICG och 300 mikroliter serum gratis Dulbecco ändrade Eagles medium.
- Skaka försiktigt nya transfektion lösning för 5 minuter så komplex att bilda.
- Märkningen lösningen är färdig.
- Sug ut det gamla mediet från hESC 10mm petriskål.
- Tillsätt 5 ml förvärmda serumfritt DMEM.
- Lägg till den tidigare beredda Protamin / ICG lösning på cellerna. Starta en timmes inkubation genom att placera skålen i en inkubator vid 37 ° C.
- Efter inkubationen är klar, ta bort skålen från kuvösen och sug ut märkningen lösningen.
- Tvätta cellerna genom att skölja skålen med 5 ml PBS.
- Sug ut PBS och ersätt med 5 ml 0,25% Trypsin. Inkubera skålen vid 37 ° C i 5 minuter så att trypsinization uppstå. Det hjälper att skaka skålen lite varje gång i en stund.
- Försiktigt pipettera upp och ner, att bryta upp de kvarvarande kolonier.
- Neutralisera Trypsin genom att lägga till lika mycket KSR till skålen.
- Överför cellen lösning till en 15 ml rör och centrifugera lösningen vid 400 RCF i 5 minuter.
- Resuspendera cellerna i full medier.
- Om det fortfarande är klumpar på denna punkt, trypsinize och centrifugera igen.
- När en klumpfri cell lösning uppnås, aspirera ut den gamla medier och återsuspendera pelleten i 10 ml förvärmda hela ESC medier.
- På denna punkt är det nödvändigt att skilja cellerna musen mataren från hESCs. Detta görs för att säkerställa att senare förekommer endast avbildning av stamceller.
- För detta, överföring the cell lösning på ett gelatin belagd 10 cm maträtt.
- Sätt skålen i 37 ° C inkubator och låt det sitta i 45 minuter. Under denna tid, se till att inte störa skålen. Nu kommer matare följa skålen och stamceller kommer inte.
- Överför lösningen ur petriskål. och nu har vi en märkt enstaka celler lösning av mänskliga embryonala stamceller.
- Cellerna kan nu räknas och en Trypan blå test kan utföras på dem.
- Cellerna är redo att avbildas!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI är en relativt ny bildteknik, som bygger på detektering av fluorescens. OI är lika känslig som radiotracer-baserade avbildningstekniker, men inte associerat med någon bestrålning exponering. OI ger ett effektivt sätt att spåra celler icke-invasivt och upprepade gånger, vilket ger en inblick i cell migration till målsidan. En stor begränsning av tekniken är den begränsade vävnaden penetration av fluorescerande prober in vivo. Således, ett spårämne ackumulering i djupa vävnader, mer än ca 50-10 cm från huden inte kan upptäckas. Aktuella kliniska tillämpningar är begränsade till ytliga tekniker såsom endoskopisk, hjärt-och retinae imaging (Funovics et al. 2003) men den här domänen av forskningen kommer att fortsätta att expandera genom erkännandet av de stora möjligheter som in vivo-cell tracking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet fick stöd av en Leon J. Thal SEED anslag från California Institute för regenerativ medicin. Tobias Henning har finansierats av ett Research stipendium från den tyska Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Vi vill tacksamt erkänna Juanito Meneses för hans råd om odling av mänskliga embryonala stamceller.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
- Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
