Summary
نعرض طريقة بسيطة وسريعة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل.
Abstract
الهيئات مضغي الشكل (EB) هي مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية. الطريقة الأكثر شيوعا لإنشاء هذه المجاميع هو الأسلوب قطرة شنقا ، نهجا شاقة من pipetting عدد التعسفي من الخلايا في لوحات جيدا. التفاعلات بين الخلايا الجذعية يجبرن على مقربة من بعضها البعض يروج لجيل من EBS. لأن وسائل الإعلام في كل من الآبار والتي يتم تبادلها يدويا كل يوم ، وهذا النهج هو مكثفة يدويا.
وعلاوة على ذلك ، لأن المعايير البيئية بما في ذلك خلية خلية ، والتفاعلات عامل الخلية القابلة للذوبان ، ودرجة الحموضة ، وتوافر الأكسجين ويمكن لحجم المهام EB ، يمكن الحصول عليها من السكان الخلية التقليدية قطرات شنقا حتى عندما تختلف بشكل كبير مثقف في ظل ظروف مماثلة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة حقا أن العدد الأولي من الخلايا التي تشكل مجموع يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على تمايز الخلايا الجذعية. طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب أي معدات متخصصة. نظهر هذا الأسلوب من خلال إنشاء هيئات مضغي الشكل باستخدام الخلايا الحمراء الفلورسنت الماوس سطر (129S6B6 - F1).
Protocol
1. صنع قالب Shrinky - دينك
- طباعة النمط المطلوب على shrinky - دينك ورقة باستخدام الطابعة تعريف جيد.
- خبز shrinky - دينك ورقة في 163 درجة مئوية لمدة حوالي 10 دقيقة حتى ، أو تقلصت بشكل كامل وبعد أن حصلت على شكل منتظم.
- بعد shrinky - دينك العفن هدأت ، يغرق في حمام الأيزوبروبانول حتى بالكاد يغطي سطح كاملة.
- بعناية ، رش بعض الأسيتون على العفن ويهز الحاويات عدة مرات. لإضافة المزيد من الأيزوبروبانول تغسل الزائدة الأسيتون وكرر هذه الخطوة عدة مرات حتى shrinky العفن تبدو نظيفة.
- تزج العفن في الماء المقطر لمدة 10 دقيقة ليغسل المتبقية أي مذيب عضوي.
- الهواء النظيف shrinky العفن. إعادة الحرارة لمدة حوالي 5 دقائق على 163 درجة مئوية وهذا الحبر المدمجة وتتبخر أي مذيب المتبقية.
2. جعل PDMS microwells
- إعداد 10:01 PDMS خليط كيل / علاج ، وتستنهض الهمم بقوة لبضع دقائق.
- مكان shrinky - دينك العفن في طبق بتري الصغيرة. يصب الخليط PDMS حتى يصل حوالي 1 / 2 سم فوق سطح القالب.
- طبق في ظل فراغ الجرس للقضاء على جميع الفقاعات من خليط PDMS.
- طبق مكان في الفرن عند 70 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
- قطع PDMS الصلبة من العفن وربط لشريحة الزجاج فقط من خلال ممارسة الضغط.
- تجاهل first microwell رقاقة ، لأنه بقايا الحبر incrusted بين PDMS.
- كرر هذا الإجراء لإنتاج شريحة الثانية التي هي خالية من الحبر ، وشكل أكثر تحديدا.
- تنظيف رقاقة microwell باستخدام 70 ٪ حل الايثانول. وضعه تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق لتعقيم عليه.
3. محاصرة الخلايا في microwells
- عدد الخلايا وتخفيف لهم في وسائل الاعلام الى التركيز الثقافة المطلوب (اعتمادا على كيفية العديد من الخلايا الأولية في الآبار التي ترغب). اعتدنا على سبيل المثال ، للحصول على ما يقرب من 10-15 في الخلايا بشكل جيد (متوسط = 11 ، SD = 5.4 ، ومعدل التحميل = 93 ٪) ، وتركيز 8 × 10 4 خلايا / مل. لتركيز 17 × 10 4 خلايا / مل ، يمكن أن نحصل موثوق بين 25 و 35 خلايا لكل بئر (متوسط = 27.17857 SD = 7.7 ، ومعدل التحميل = 100 ٪).
- المكان بعناية microwell رقاقة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل تحتوي على قاعدة PDMS طدت.
- إضافة حوالي مل 2JDP من الحل الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في الدقيقة 760 ، و 4 درجات مئوية.
- الماصة من حل الزائدة وغسل بعناية microwell مع الحل 1X PBS.
- microwell مكان في صحن بيتري الصغيرة ، والحرص أثناء تناول شريحة من أنبوب الطرد المركزي.
- غسل الزائد باستخدام خلية 1 حل PBS X.
- مكان microwell رقاقة تحت مجهر مقلوب للتحقق من عدد من الخلايا المقصود لكل بئر.
- احتضان microwell تحتوي على خلايا في الظروف القياسية.
4. خلية الحضانة
- اتباع بروتوكول EB طبيعي في المختبر.
- تغيير المتوسطة ببطء من جانب الغرفة ، وتجنب تعكير خلية في microwell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طورنا طريقة بسيطة الثقافة وسريعة ، وقابلة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار microfabricated (مصبوب من Dinks - Shrinky) والمحافظة عليها من أجل التنمية الجسم مضغي الشكل. أخيرا ، فإن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة لمزيد من التحليل والتجريب. هذه الطريقة هي قابلة لأي مختبر ويتطلب أي معدات مخصصة لأننا تغني عن الحاجة إلى ضوئيه. يمكننا أن يختلف حجم microwells فضلا عن تركيز خلايا / بئرا لتغيير عدد وحجم الهيئات مضغي الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر CIRM لدعم هذا العمل. وقد تم التبرع بسخاء خط خلية من الدكتور أندراس ناجي في مستشفى ماونت سيناي في تورنتو ، أونتاريو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
