Summary
我们展示一个简单而快速的方法加载到预先定义的数字，微型井细胞胚体的发展和维护。
Abstract
胚体（EB）的胚胎干细胞的聚集。创建这些聚集的最常用的方法是悬滴法，孔板移液到任意数量的细胞费力的方法。被迫彼此接近的干细胞之间的相互作用，促进了EBS的一代。因为在每个井的媒体每天要手动交换，这种做法是手动密集。
此外，因为环境参数，包括细胞，细胞可溶性因子的相互作用，pH值，和氧气供应的EB大小的功能，从传统的挂滴获得的细胞群可以相差很大，即使在相同条件下培养。的确，最近的研究表明，初步形成总额的细胞数量有重大影响干细胞分化。我们已经开发出一种简单，快速，可伸缩的文化的方法加载到预先定义的数字，微型井细胞胚体的发展和维护。最后，这些细胞是方便作进一步的分析和实验。这种方法适合任何实验室，无需专用设备。我们通过这种方法使用红色荧光的小鼠细胞株（129S6B6 F1），胚体。
Protocol
1。制作Shrinky，丁克模具
- shrinky，丁克表使用一个很好的定义打印机打印所需的图案。
- 烘烤shrinky丁克表在163℃，约10分钟，或直至完全萎缩，并取得了一个常规的形状。
- shrinky，丁克模具冷却下来后，把它浸入异丙醇洗澡，直到完整的表面几乎覆盖。
- 小心，喷在模具丙酮和摇晃容器几次。添加更多的异丙醇洗出丙酮过剩，重复此步骤几次，直到shrinky模看上去干净。
- 模具在蒸馏水中浸泡10分钟洗掉任何剩余的有机溶剂。
- 空气清新shrinky模具。再加热5分钟左右，在163 ° C的紧凑型油墨，任何剩余的溶剂蒸发。
2。使PDMS的微孔
- 准备10:1的PDMS /固化剂混合，搅拌几分钟大力。
- 在一个小培养皿放置shrinky丁克模具。倒入PDMS的混合物，直到它到达了在模具表面约1 / 2厘米。
- 将盘在真空状态下铃PDMS的混合物，以消除所有气泡。
- 放置在烤箱菜在70 ° C，隔夜。
- 切断从固体硅橡胶模具和施加压力，只是绑定到载玻片。
- 第一微孔片丢弃，因为它有油墨残留物之间的PDMS结垢。
- 重复此过程，以便培育出第二代的芯片，它是墨自由和有一个更明确的形状。
- 清洁微孔芯片采用70％乙醇溶液。紫外线光源下放置10分钟消毒。
3。补漏细胞在微孔
- 计数细胞和培养基稀释到所需浓度（取决于你想多少井的初始细胞）。例如，要获得约10-15％细胞（平均= 11，SD = 5.4，负荷率= 93％），我们用浓度为8 × 10 4细胞/ ml。对于一个17 × 10 4细胞/ ml的浓度，可以可靠地获得25和35之间，每孔细胞（平均= 27.17857 SD = 7.7，负荷率= 100％） 。
- 小心地将50 mL离心管中包含一个固化硅橡胶基地的微孔芯片。
- 新增约2JDP毫升的细胞液。
- 离心5分钟，在760 RPM和4 ° C
- 吸取多余的解决方案，并认真洗手，用PBS 1X解决方案的微孔。
- 放置在一个小petry菜的微孔，同时利用离心管芯片小心。
- 使用1 × PBS液洗细胞多余的。
- 微孔芯片置于倒置显微镜下每孔的细胞数，以验证打算。
- 孵育微孔包含在标准条件下的细胞。
4。细胞孵育
- 在实验室按照正常的EB协议。
- 慢慢地改变从会议厅一侧的介质，避免干扰细胞中的微孔。
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Discussion
我们已经开发出一种简单，快速，可伸缩的培养方法加载到微井（Shrinky - Dinks成型）预先定义的细胞数目和他们保持胚体的发展。最后，这些细胞是方便作进一步的分析和实验。这种方法适合任何实验室，不需要专用的设备，因为我们排除光刻需要。我们可以改变的微孔的大小以及细胞/井的浓度改变胚体的数量和大小。
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Acknowledgments
我们要感谢支持这项工作摆围。安德拉什纳吉博士在西奈山医院，多伦多，安大略省的细胞系的慷慨捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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