Summary
Wir zeigen eine einfache und schnelle Methode, um vordefinierte Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung.
Abstract
Embryoid Körper (EB) sind Aggregate aus embryonalen Stammzellen. Die häufigste Art der Erstellung dieser Aggregate ist der hängende Tropfen-Methode, eine mühsame Annäherung Pipettieren eine beliebige Anzahl von Zellen in Mikrotiterplatten. Die Wechselwirkungen zwischen den Stammzellen in unmittelbarer Nähe voneinander gezwungen fördert die Generation der EBS. Weil die Medien in jede der Vertiefungen muss manuell ausgetauscht werden jeden Tag, ist dieser Ansatz manuell intensiv.
Darüber hinaus, weil Umwelt-Parameter einschließlich Zell-Zell-, Zell-löslichen Faktor-Interaktionen, pH und Sauerstoff Verfügbarkeit kann Funktionen der EB groß sein, können Zellpopulationen aus traditionellen hängende Tropfen erhalten dramatisch unterscheiden, auch wenn unter identischen Bedingungen kultiviert. Jüngste Studien haben zwar gezeigt, dass die anfängliche Anzahl von Zellen bilden das Aggregat kann erhebliche Auswirkungen auf Stammzell-Differenzierung haben. Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Wir demonstrieren diese Methode, indem Embryoidkörpern mit einem rot fluoreszierenden Maus-Zelllinie (129S6B6-F1).
Protocol
1. Machen Shrinky-Dink Mold
- Drucken Sie das gewünschte Muster auf Shrinky-dink Blatt mit einer guten Definition Drucker.
- Bake Shrinky-dink Blatt bei 163 ° C etwa 10 Minuten, oder bis es vollständig geschrumpft und erworben haben eine regelmäßige Form.
- Nach Shrinky-dink Form abgekühlt ist, tauchen Sie es in einem Isopropanol-Bad, bis die gesamte Oberfläche ist kaum abgedeckt.
- Vorsichtig Spray etwas Aceton über die Form und schütteln Container ein paar mal. Fügen Sie weitere Isopropanol auswaschen Aceton Exzess und wiederholen Sie diesen Schritt ein paar Mal, bis Shrinky-mold sieht sauber.
- Tauchen Schimmel in destilliertem Wasser für 10 Minuten abwaschen verbleibende organische Lösungsmittel.
- Air sauber Shrinky-Form. Re-heat es für etwa 5 Minuten bei 163 ° C. Dadurch wird kompakt Tinte und verdampfen alle verbleibenden Lösungsmittel.
2. Machen PDMS Kavitäten
- Bereiten Sie eine 10:1-PDMS / Härter-Gemisch, und schütteln kräftig für wenige Minuten.
- Legen Sie Shrinky-dink Schimmel in eine kleine Petrischale. Gießen PDMS-Mischung, bis sie über 1 / 2 cm über der Oberfläche der Form erreicht.
- Legen Gericht unter Vakuum Glocke um alle Luft aus PDMS-Mischung zu beseitigen.
- Legen Gericht im Ofen bei 70 ° C, über Nacht.
- Cut off feste PDMS von Schimmel und binden ihn an einen Glasträger nur durch Anwendung von Druck.
- Discard ersten Mikrotiterplatten-Chip, da es Farbreste zwischen PDMS verkrustet ist.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem zweiten Chip, der Ink-frei ist und hat eine definierte Form zu produzieren.
- Saubere Mikrotiterplatten-Chip mit 70% Ethanol-Lösung. Legen Sie sie unter UV-Lichtquelle für 10 Minuten, um es zu sterilisieren.
3. Trapping-Zellen in Mikrotiterplatten
- Zählen von Zellen und verdünnen sie in Kulturmedien auf die gewünschte Konzentration (je nachdem, wie viele erste Zellen in Vertiefungen möchten). Zum Beispiel, um etwa 10-15 Zellen pro Well (Durchschnitt = 11, SD = 5,4, loading rate = 93%) zu erhalten, verwendeten wir eine Konzentration von 8 x 10 4 Zellen / ml. Bei einer Konzentration von 17 × 10 4 Zellen / ml, könnten wir sicher bekommen zwischen 25 und 35 Zellen pro Well (Durchschnitt = 27,17857 SD = 7,7, loading rate = 100%).
- Vorsichtig Mikrotiterplatten-Chip in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit einer verfestigten PDMS Basis.
- Fügen Sie über 2JDP ml der Zell-Lösung.
- Zentrifuge für 5 Minuten bei 760 rpm und 4 ° C.
- Pipet überschüssige Lösung und sorgfältig zu waschen Mikrotiterplatten mit PBS 1X-Lösung.
- Legen Mikrotiterplatten in einer kleinen Schüssel Petry, wobei darauf geachtet während der Einnahme der Chip aus dem Zentrifugenröhrchen.
- Wash Zelle mehr mit 1 X PBS-Lösung.
- Legen Mikrotiterplatten-Chip unter einem inversen Mikroskop bestimmt Anzahl von Zellen pro Vertiefung zu überprüfen.
- Inkubieren Mikrotiterplatte enthaltenden Zellen bei Standardbedingungen.
4. Zellinkubation
- Folgen Sie den normalen EB-Protokoll in das Labor.
- Ändern Sie das Medium langsam von der Seite der Kammer; stören die Zelle in die Vertiefungen.
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Discussion
Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrostrukturierten Vertiefungen (geformt aus Shrinky-Dinks) zu laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung, weil wir die Notwendigkeit für die Photolithographie zu vermeiden. Wir können variieren die Größe der Kavitäten sowie die Konzentration der Zellen / Brunnen, um die Anzahl und Größe der Embryoidkörpern ändern.
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Acknowledgments
Wir möchten CIRM für die Unterstützung dieser Arbeit danken. Die Zelllinie wurde großzügig von Dr. Andras Nagy am Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario gespendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
