Summary
我々は微細加工のウェルに細胞の事前定義された数値をロードし、胚様体の開発のためにそれらを維持するために簡単かつ迅速な方法を示しています。
Abstract
胚様体（EB）は、胚性幹細胞の集合体です。これらの集計を作成する最も一般的な方法は、ハンギングドロップ法、ウェルプレートに細胞を任意の数のピペッティングの面倒なアプローチです。互いの接近に強制的に幹細胞間の相互作用は、EBSの生成を促進。各ウェル内のメディアを手動で毎日交換する必要があるため、このアプローチは、手作業の多いです。
同一の条件下で培養するとさらに、細胞 - 細胞、細胞可溶性因子の相互作用は、pH、及び酸素の可用性を含む、環境パラメータは、EBの大きさの関数である可能性があるため、従来の吊り下げ降下から得られた細胞集団は、さらに劇的に異なることがあります。最近の研究では、実際に集計を形成する細胞の初期数は、幹細胞の分化に大きな影響を持つことができることが示されている。 Weは、微細加工のウェルに細胞の定義済みの数値をロードし、胚様体の開発のためのそれらを維持するために、シンプル、迅速、かつスケーラブルな培養法を開発した。最後に、これらの細胞は、さらに分析と実験のために簡単にアクセス可能です。このメソッドは、どの研究室に適していると、専用機器を必要としません。私たちは、赤色蛍光マウスの細胞株（129S6B6 - F1）を使用して胚様体を作成して、このメソッドを示しています。
Protocol
1。 Shrinky -ディンク金型を作る
- 良い定義のプリンターを使用してshrinky -ディンクのシート上に所望のパターンを印刷します。
- 163で焼くshrinky -ディンクシート℃で約10分間、または完全に縮小し、定期的な形状を取得した時まで。
- shrinky -ディンクの金型冷却された後、イソプロパノール浴に浸し、それは完全な表面はほとんどカバーされるまで。
- 慎重に、金型の上にいくつかのアセトンをスプレーし、容器を数回振る。アセトンの過剰を洗い流すとshrinky -カビがきれいになってまで、この手順を数回繰り返すよりイソプロパノール追加。
- 残りの有機溶剤を洗い落とすために10分間蒸留水に浸けてカビ。
- エアクリーンshrinkyモールド。この意志コンパクトなインク163℃で約5分間、それを再加熱し、残りの溶剤を蒸発させる。
2。 PDMSマイクロウェルの作成
- 10時01 PDMS /硬化剤の混合物を準備し、数分間激しく振とうする。
- 小さなペトリ皿で行わshrinky -ディンクのモールド。それは金型表面上の約1 / 2 cmに達するまでPDMSの混合物を注ぐ。
- PDMSの混合物からすべての気泡を除去するため真空鐘の下に皿を置きます。
- 70℃のオーブンで行わ皿° C、一晩。
- 金型から固体PDMSを遮断し、単に圧力を適用することにより、ガラススライドにバインドします。
- それは、PDMSとの間でincrustedインクの残基を有しているため、最初にマイクロチップを捨てる。
- インクフリーであると、より定義された形状を持つ別のチップを製造するには、この手順を繰り返します。
- クリーンマイクロチップの70％エタノール溶液を用いた。それを殺菌するために10分間UV光源の下に置きます。
3。マイクロウェルにトラップ細胞
- 細胞をカウントし、所望の濃度（希望するどのように多くの井戸の最初のセルに応じて）に培地でそれらを希釈する。例えば、ウェルあたり約10〜15セル（平均= 11、SD = 5.4、積載率= 93％）を得るために、我々は、8 × 10 4細胞/ mlの濃度を使用していました。 17 × 10 4細胞/ mlの濃度の場合、我々は確実によくあたり25〜35セル（平均= 27.17857 SDは= 7.7、積載率= 100％）得ることができる。
- 慎重に固化したPDMSの塩基を含む50 ml遠心チューブにマイクロチップを置きます。
- 細胞溶液の2JDP ml程度追加。
- 5 760 rpmで分、4℃のための遠心分離機
- 過剰の溶液からピペットで慎重にPBS 1Xソリューションをマイクロウェルを洗う。
- 遠心管からチップを取り出しながら、注意しながら、小さなペトリ皿の中でのマイクロウェルを置きます。
- 1 X PBS溶液を用いて細胞の過剰を洗ってください。
- ウェルあたりの細胞の目的の数を確認するために倒立顕微鏡下でマイクロウェルチップを置きます。
- 標準的な条件下でマイクロウェルを含む細胞をインキュベートする。
4。細胞のインキュベーション
- ラボでの通常のEBのプロトコルに従ってください。
- 徐々にチャンバーの側からメディアを変更してください。マイクロウェルに細胞を乱すことを避ける。
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Discussion
Weは、微細加工井戸（Shrinky - DINKSから成形された）へのセルの定義済みの数値をロードし、胚様体の開発のためにそれらを維持するために、シンプル、迅速、かつスケーラブルな培養法を開発した。最後に、これらの細胞は、さらに分析と実験のために簡単にアクセス可能です。このメソッドは、どの研究室に適していると我々はフォトリソグラフィの必要性を未然に防ぐため、専用機器を必要としません。我々は、胚様体の数とサイズを変更するにはマイクロウェルの大きさだけでなく、細胞/ウェルの濃度を変化させることができます。
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Acknowledgments
我々はこの作業の支援のためCIRMに感謝します。細胞株は、寛大にマウントサイナイ病院、トロント、オンタリオ州で博士アンドラーシュNagy氏から寄贈されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
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- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
