Summary
우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다.
Abstract
Embryoid 단체 (EB)는 배아 줄기 세포 집합체입니다. 이러한 집합체를 만드는 가장 일반적인 방법은 매달려 드롭 방식, 잘 접시에 세포의 임의의 숫자를 pipetting의 힘드는 접근이다. 서로의 가까이에 강제 줄기 세포 사이의 상호 작용은 EBS의 생성을 촉진. 우물의 각 미디어가 수동으로 매일 교환해야했기 때문에, 이러한 방식은 수동으로 집약적이다.
동일한 조건에서 양식 때 또한, 셀 셀, 셀 용해 계수 상호 작용, 산도, 그리고 산소의 가용성을 포함한 환경 매개 변수 EB 크기의 기능을 수 있기 때문에, 전통적인 매달려 방울에서 얻은 세포 집단도 크게 다를 수 있습니다. 최근 연구는 실제로 집계를 형성하는 세포의 초기 숫자가 줄기 세포 분화에 중요한 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 붉은 형광 마우스 세포 라인을 (129S6B6 - F1)를 사용 embryoid 시체를 작성하여이 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. Shrinky - 딩크 몰드 만들기
- 좋은 정의 프린터를 사용 shrinky - 딩크 시트에 원하는 패턴을 인쇄합니다.
- 163에서 베이크 shrinky - 딩크 시트 ° C 약 10 분, 또는 때까지 대해 전적으로 축소하고 정기적인 모양을 인수하는 데.
- shrinky - 딩크의 금형이 냉각되면, 이소프로판올 욕조에서 잠수함 그것은 전체 표면은 거의 덮여 때까지.
- 신중하게, 금형을 통해 몇 가지 아세톤을 스프레이하고 컨테이너 몇 번 흔들. 아세톤의 초과를 씻고 shrinky - 곰팡이가 깨끗해 보여요 때까지이 단계 몇 번 반복해야 더 이소프로판올 추가합니다.
- 남아있는 유기 용매 씻어 10 분 정도 증류수에 담가 곰팡이.
- 에어 shrinky - 곰팡이 청소. 163에서 5 분 동안 그것을 다시 열 ° C. 이것은 남아있는 용매를 증발 압축 잉크 및됩니다.
2. PDMS microwells 만들기
- 10시 1분 PDMS / 치료 에이전트 혼합물을 준비하고, 몇 분 동안 적극적으로 선동.
- 작은 페트리 접시에 넣어 shrinky - 딩크 금형. 그것은 금형 표면 2분의 1에 대한 cm에 도달할 때까지 PDMS 혼합물을 붓고.
- PDMS 혼합물에서 모든 거품을 제거하기 위해 진공 종 아래 플레이스 요리.
- 70 오븐에 넣어 요리 ° C, 하룻밤.
- 금형에서 고체 PDMS를 차단하고 단지 압력을 적용하여 유리 슬라이드에 바인딩합니다.
- 그것이 PDMS 사이 incrusted 잉크 잔류물을 가지고 있기 때문에, 첫번째 microwell 칩 폐기하십시오.
- 잉크 무료이며 더 정의된 모양을 가지고 두 번째 칩을 생산하기 위해이 절차를 반복합니다.
- 청소는 microwell 칩 70 % 에탄올 솔루션을 사용합니다. 그것을 소독하기 위해 10 분 동안 자외선 광원 아래로 놓으십시오.
3. microwells에서 트래핑 세포
- 세포를 카운트하고 원하는 농도 (당신이 싶은 얼마나 많은 우물의 초기 세포에 따라)에 문화 미디어에서 그들을 희석. 예를 들어, 잘 당 약 10-15 세포 (평균 = 11, SD = 5.4, 로딩 속도 = 93%)하기 위해서, 우리는 8 농도 × 10 4 세포 / ML를 사용합니다. 17 × 10 4 세포 / ML의 농도에 대해서는 안정적으로 잘 당 25의 사이 35 세포를 (평균 = 27.17857 SD는 = 7.7, 로딩 속도 = 100 %)받을 수 있습니다.
- 조심스럽게 확정 PDMS 기반을 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브의 microwell 칩 장소.
- 세포 솔루션의 2JDP ML에 대한 추가합니다.
- 5 760 RPM 분만에 4 ° C.위한 원심 분리기
- 초과 솔루션 아웃 Pipet 조심스럽게 PBS 1X 솔루션 microwell 씻는다.
- 원심 분리기 튜브의 칩을하면서 조심하고, 작은 페트리 접시에 microwell를 배치합니다.
- 1 X PBS 솔루션을 사용하여 셀 초과 씻으십시오.
- 물론 당 세포의 의도 번호를 확인할 수 거꾸로 현미경 microwell 칩을 놓으십시오.
- 부화 microwell 표준 조건에서 세포를 포함하는.
4. 세포 배양
- 연구실에 정상 EB 프로토콜을 따르십시오.
- 천천히 챔버의 측면에서 매체를 변경, microwell에있는 세포를 방해하지 마십시오.
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Discussion
우리는 microfabricated 웰스 (Shrinky - Dinks에서 성형)에 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며, 우리가 석판술의 필요성을 사전에 제거하다 때문에 아무 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 embryoid 기관의 수와 크기를 변경할 수있는 microwells의 크기뿐만 아니라 세포 / 웰스의 농도를 다를 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는이 작품의 지원 CIRM 감사하고 싶습니다. 셀 라인은 넉넉한 마운트시나이 병원, 토론토, 온타리오에서 박사 Andras 나지에서 기증되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
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