Summary
In deze video laten we een procedure voor een nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel met een nieuw miniatuur gen pistool. We kloppen beneden de uitdrukking van het axon begeleiding molecuul netrine in bloedzuiger embryo's door het leveren van moleculen van dsRNA in het ventrale lichaam muur en ganglia van de afzonderlijke segmenten.
Abstract
In deze video, tonen we het gebruik van een pneumatisch capillaire pistool voor de nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel. We maken gebruik van de procedure voor verstoren genexpressie patronen in geselecteerde segmenten van de bloedzuiger embryo's, waardoor de onbehandelde segmenten als interne controles.
De pneumatische capillaire pistool kan worden gebruikt om interne lagen van cellen te bereiken in een vroeg stadium van ontwikkeling zonder het openen van het monster. Als een methode voor gelokaliseerde introductie van stoffen in levende weefsels, de biolistische levering met het pistool heeft verschillende voordelen: het is snel, contact-vrije en niet-destructief. Bovendien kan een enkele capillair pistool gebruikt worden voor zelfstandige levering van verschillende stoffen. De levering regio kan hebben zijdelingse afmetingen van ~ 50 tot 150 micrometer en strekt zich uit over ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, dat is instelbaar tussen 0 en 50 um. Deze levering heeft het voordeel van de mogelijkheid om een beperkt aantal cellen doel in een geselecteerde locatie midden houdt tussen enkele cel knock down door micro-injectie en de systemische knockdown door extracellulaire injecties of door middel van genetische benaderingen.
Voor kloppen beneden of kloppen in de expressie van het axon begeleiding molecuul netrine, die natuurlijk wordt uitgedrukt door enkele centrale neuronen en in de ventrale lichaam muur, maar niet de rug-domein, leveren wij moleculen van dsRNA of plasmide-DNA in het lichaam muur en centrale ganglia. Deze procedure omvat de volgende stappen: (i) de voorbereiding van de experimentele opstelling voor een specifieke test (het aanpassen van de versnelde druk), (ii) het bekleden van de deeltjes met moleculen van dsRNA of DNA, (iii) het laden van de gecoate deeltjes in het pistool, maximaal twee reagentia in een assay, (iv) de voorbereiding van de dieren voor het deeltje levering, (v) de levering van gecoate deeltjes in het te onderzoeken weefsel (body muur of ganglia), en (vi) de verwerking van de embryo's (immunokleuring, immunohistochemie en neuronale etikettering) om de resultaten te visualiseren, meestal 2 tot 3 dagen na de bevalling.
Wanneer de deeltjes werden bekleed met netrine dsRNA, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukking die zich alleen in cellen met deeltjes (meestal, 1-2 deeltjes per cel). Deeltjes bedekt met een plasmide coderend voor EGFP geïnduceerde fluorescentie in neuronale cellen wanneer ze gestopt in hun kernen.
Protocol
Deeltjes kunnen worden gecoat met verschillende reagentia, zoals dsRNA moleculen, DNA-plasmiden of kleurstoffen. Het type en de diameter van de deeltjes worden gekozen op basis van het reagens en de diepte van het doel cellen in het weefsel: grotere deeltjes dringen verder, maar kan wat schade aan het weefsel veroorzaken.
1. De voorbereiding van dsRNA gecoate deeltjes
- Plaats 100% isopropanol op ijs.
- Resuspendeer 5 mg gouddeeltjes (S1600ri, Seashell Technology, LLC; gemiddelde diameter 1,6 micrometer) in 100 ml bindingsbuffer. Wanneer oplossing klaar is, gaat u naar de volgende stap.
- Verdun de oplossing deeltjes door het toevoegen van 100 ul van de bindende buffer, vortex kort en ultrasone trillingen voor 1-2 min om te voorkomen dat klonteren.
- Voeg 5-10μg van dsRNA / siRNA (dsRNA's / siRNA moet worden opgelost in water tot een concentratie van ~ 1μg/μl).
- Vortex en laat op kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Deze concentratie en tijdsinterval resulteren in siRNA verzadigde gouddeeltjes.
- Pellet het siRNA / goud deeltje complexen door centrifugeren bij ~ 2500 rpm in een bench top centrifuge voor ~ 15 sec.
- Verwijder het supernatant voorzichtig 750 ml koude isopropanol toe te voegen met een minimale verstoring van de pellet. Spin kort en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de gouddeeltjes in 100 ul koude 100% isopropanol, daarna kort met ultrasone trillingen in een bad ultrasoonapparaat (2-3 pulsen) te breken deeltje agglomeraten. Laatste, giet de zwevende deeltjes op een glasplaatje en laten drogen bij kamertemperatuur.
2. De voorbereiding van de experimentele opstelling voor een specifieke test
- Elk wapen heeft een andere nozzle opening diameter, variërend van een minimum van ~ 50μm tot ~ 3 mm. De specifieke te worden gebruikt voor het pistool is daarom voor gekozen afhankelijk van het gebied van weefsel worden gericht.
- De druk Hij is aangepast voor de diepte in het weefsel van de doelcellen, in het algemeen tot ~ 100 urn (een hogere druk kan leveren de deeltjes dieper). De afstand tussen het embryo en het uiteinde van het mondstuk beïnvloedt ook de penetratie diepte, als goud deeltjes los momentum in de lucht.
3. Het laden van het geweer met de pre-gecoate deeltjes
Deeltjes mogen worden geladen als een droog poeder in de Tygon slang deeltje injectie die verbonden zijn met het spruitstuk. Deze buizen, die moet in een droge atmosfeer worden bewaard bij 4 ° C wanneer deze niet in gebruik is, kan worden hergebruikt in andere experimenten met dezelfde reagentia. Onze experimentele opstelling kunnen tot twee verschillende reagentia per test via verschillende havens in het spruitstuk.
- Schraap de gedroogde gecoate deeltjes uit de glaasjes met de rand van een glazen deksel slip of een scheermesje voordat u ze in de Tygon slang lijn. Deze Tygon slang wordt specifiek alleen voor deze reagens om kruisbesmetting te voorkomen.
- Als je last van de deeltjes, buig de slang in een U-vorm dicht bij de connector, om de deeltjes te houden van het verspreiden langs de gehele buis en geconcentreerd dicht bij de connector. Pak de deeltjes met een kleine spatel of een stuk van gevouwen papier af te wegen, en de belasting ongeveer de helft van hen in de slang voor elke reeks van embryo's. Tik op de buis tijdens het laden stap om gelijkmatig verdelen de deeltjes.
4. Dier Voorbereiding
Voor en na het goud deeltje levering, worden de embryo's bewaard in steriel kunstmatige vijver water op kamertemperatuur.
- Leg de embryo's, ventrale zijde, in een groef gesneden in een flat, 5mm dik stuk silicone rubber (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en verdoven ze in een oplossing van 8% ethanol in steriel kunstmatige vijverwater ( jongere embryo's in stadium E6-E8 kan blijven in kunstmatige vijverwater zonder ethanol gedurende het experiment).
- Onmiddellijk voorafgaand aan het schieten van de deeltjes, hoe lager het bad niveau om het ventrale oppervlak van de embryo's bloot te leggen door het verwijderen van een deel van de oplossing. Leg een stukje weefsel papier met een klein gat in het midden op de top van om het te stabiliseren en het oppervlak niet uitdrogen.
5. Levering van gecoate deeltjes in het doel weefsel
Een lading van de deeltjes kan meestal worden gebruikt voor maximaal tien opnamen, met een enkel schot meestal het waarmaken van de orde van een paar honderd deeltjes.
- Genereer een schot door het openen van een van de kleppen voor 0,3 s, waardoor de injectie van een bolus van deeltjes uit de bijbehorende slang lijn in het geweer.
- Tik zachtjes tegen de slang tussen de schoten om deeltjes uit de slang muur los en dus ook hun injectie te vergemakkelijken in de Hij stroom van het pistool.
- Ter dekking van het gebied van weefsel van belang, kan meerdere foto's nodig zijn.
- Na het deeltje levering, plaats de embryo's terug in kunstmatige vijver, bij voorkeur een embryo per putje in een multi-well plaat.
6. Immunovlekken en neuronale etikettering
Houd de embryo's bij kamertemperatuur en in het donker voor 1 tot 3 dagen na het deeltje aflevering, pas op RNAi (of ectopische expressie) wordt bereikt. We voeren vervolgens een van de volgende procedures op de experimentele monsters en controles:
- In situ hybridisatie aan test voor de aanwezigheid of afwezigheid van netrine mRNA. Digoxigenine-gelabeld leech netrine riboprobes worden gehybridiseerd om hele leech embryo's.
- Immunocytochemie te assay voor netrine eiwit en andere eiwitten die uniek zijn voor neuronaal weefsel (zoals anti geacetyleerde tubuline). De procedure wordt ook uitgevoerd op hele-mount embryo's.
- Micro-injecties van lipofiele kleurstoffen (DII en DIO) in enkele neuronen, voor dye-vult het labelen van de complete cilinders van de neuronen van belang (mechanosensorische druk neuronen in ons geval) in behandelde en controle segmenten. Deze test wordt uitgevoerd op levende embryo's (intacte of ontleed).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze demonstratie, gebruikten we de pneumatische capillaire gun om gouddeeltjes te leveren in de cellen in kleine lokale volume van een live-bloedzuiger embryo te kloppen in en-down klop genen. De beoogde regio over het algemeen had een diameter van ~ 150 urn en deeltjes werden gevonden ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, die instelbaar is tussen 0 en 50 um. Wanneer de deeltjes werden bekleed met dsRNA moleculen van het axon begeleiding factor netrine, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukking die zich alleen in cellen met deeltjes. Deeltjes bedekt met een plasmide coderend voor GFP geïnduceerde fluorescentie in neuronale cellen wanneer ze gestopt in hun kernen.
We hebben laten zien hoe je de pneumatische capillaire pistool geeft de techniek van biolistische aflevering een nieuwe mogelijkheid, te richten op microscopische regio's van een weefsel opgesloten in drie dimensies en doelgericht met hoge precisie, zonder aantoonbare schade aan het weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Dr Michael Baker te bedanken voor zijn hulp bij het genereren van concepten voor gen knock-in en voor het verstrekken van de time-lapse filmpjes van de groeiende zintuiglijke projecties. Wij zouden ook graag Virginia Vandelinder bedanken voor technische bijstand met het pneumatische pistool experimenten.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
