Summary
이 비디오에서는, 우리는 새로운 초소형 유전자 총을 가진 살아있는 조직에 시약의 정확한 biolistic 전달 절차를 보여줍니다. 우리는 복부 신체 벽 및 단일 세그먼트의 신경에 dsRNA 분자를 제공함으로써 리치 태아의 축삭지도 분자 Netrin의 표현을 노크하고 있습니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 살아있는 조직에 시약의 정확한 배달을 위해 biolistic 공압 모세관 총의 사용을 보여줍니다. 우리는 내부 통제로 치료 세그먼트를 떠나, 거머리 배아들 중 선택된 세그먼트에 교란 유전자 발현 패턴에 대한 절차를 사용합니다.
공압 모세관 총을는 표본을 열지 않고 개발의 초기 단계에서 세포의 내부 레이어에 도달하는 데 사용할 수 있습니다. 살아있는 조직으로 물질화된 도입하는 방법으로, 총을 가지고 biolistic 배달 몇 가지 장점이있다 : 그것은 빠른 연락 - 무료 비파괴입니다. 또한, 하나의 모세관 총을 서로 다른 물질의 독립적인 전송에 사용될 수 있습니다. 배달 지역 ~ 50-150 μm의 크기의 측면을 가지고 있으며 0과 50 μm의 사이에서 조정하는 의미 침투 깊이, 주변 ~ 15 μm의 이상 연장하실 수 있습니다. 이 배달 세포 주사를 통해 microinjection 및 체계 최저 또는 유전 방식에 의해 허물고 하나의 세포 사이의 중간 선택한 위치에 세포의 제한된 대상 수있는 장점이 있습니다.
쓰러뜨린 또는 자연적으로 일부 중앙 뉴런에 의해 및 복부 신체 벽 표현하는 축삭지도 분자 Netrin,하지만 등의 도메인의 표현을 두드리는 소리에 대한, 우리는 그리고 신체 벽에 dsRNA 분자 또는 플라스미드 - DNA를 제공 중앙 신경. , 총을로 코팅된 입자를 로딩 (I) 특정 분석을위한 실험 설정 (가속 압력을 조정)의 준비를하고, (ii) 코팅 dsRNA 또는 DNA의 분자와 입자 (III) :이 절차는 다음 단계를 포함 을 한 분석, (IV)의 두 시약을 (입자 전달 (V) 대상 조직 (바디 벽 또는 신경)으로 코팅 입자의 제공을위한 동물을 준비하고, (VI) 배아 가공 immunostaining, immunohistochemistry와의 연결을 납품 후 2-3일 일반적으로 결과를 시각화하는) 라벨.
입자가 netrin dsRNA와 코팅 때, 그들은 분명만을 입자를 (일반적으로, 세포 당 1-2 입자)이있는 세포에서 발생 netrin 표현의 노크 다운 표시가 발생했습니다. 입자들이 핵에 정지의 연결을 세포에 플라스미드 인코딩 EGFP 유도 형광 코팅.
Protocol
입자는 이러한 dsRNA 분자, DNA의 plasmids 또는 염료와 같은 다른 시약과 코팅 수 있습니다. 입자의 종류와 직경이 시약과 조직의 목표 세포의 깊이에 따라 선택됩니다 더욱 침투 큰 입자, 그러나 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.
1. dsRNA 코팅 입자의 준비
- 얼음 이소프로판올 100 %를 놓으십시오.
- 100 ML 바인딩 버퍼에, Resuspend 5 MG 골드 입자 (평균 직경 1.6 μm의 S1600ri, 시쉘 기술, LLC.) 솔루션 준비가되면, 다음 단계로 진행합니다.
- 바인딩 버퍼, 소용돌이 간략와 clumping 피하기 위해 1-2 분 sonicate 100 μl를 추가하여 입자 솔루션을 희석.
- dsRNA / siRNA 5 - 10μg (dsRNAs / siRNA가 ~ 1μg/μl의 농도로 물에 용해한다)을 추가합니다.
- 2 분 실온에서 와동과 둡니다. siRNA에 이러한 집중과 시간 간격 결과는 금 입자를 포화.
- 펠렛 ~ 15 초에 대한 벤치 최고 원심 분리기에 ~ 2,500 rpm으로 원심 분리하여 siRNA / 골드 입자 단지.
- 뜨는을 제거하고 부드럽게 펠렛의 최소한의 중단과 함께 750 ML 추위 이소프로판올를 추가합니다. 간략 스핀과 표면에 뜨는를 제거합니다.
- 100 μl 추위 백퍼센트 이소프로판올에서 금 입자를 Resuspend 다음 입자 agglomerates을 깨고 (2-3 펄스) 목욕탕 sonicator에 잠시 sonicate. 마지막으로, 유리 슬라이드에 정지 입자를 기름을 붓고 실온에서 건조하실 수 있습니다.
2. 특정 분석에 대한 실험 설치 준비
- 각각의 총기는 최대 ~ 3mm로 ~ 50μm 최소 이르는, 다른 노즐 조리개 직경이 있습니다. 총을 사용하는 특정 따라서 대상으로 조직의 영역에 따라 선택됩니다.
- 그는 압력은 일반적으로 최대 ~ 100μm (높은 압력이 깊은 입자를 제공할 수)에, 대상 세포의 조직에 깊이에 따라 조정됩니다. 배아와 노즐의 끝 사이의 거리는 공기 금 입자 느슨한 기세로 침투 깊이에 영향을 미칩니다.
3. 미리 코팅 입자로 총알을 장전
입자가 매니폴드에 연결된 tygon 튜빙 입자 주입 라인에 건조 분말로로드해야합니다. 4 건조한 분위기에 보관한다이 튜브, ° C 사용하지 않을 같은 시약과 추가 실험에서 다시 사용할 수있을 때. 우리 실험 설정은 다기관에서 별도의 포트를 통해 분석마다 서로 다른 두 가지 시약까지 제공할 수 있습니다.
- tygon 튜빙 라인에 그들을 로딩하기 전에 유리 커버 슬립이나 면도날의 가장자리를 사용하여 슬라이드 유리에서 건조 코팅 입자를 다쳤어요. 이 tygon 튜빙은 교차 오염을 방지하기는이 시약에 특정한 것입니다.
- 당신이 입자를로드로 전체 관 그리고 집중 가까운 커넥터에 따라 확산 입자를 유지하기 위해 커넥터에 가까운 U 모양으로 튜빙을 구부. 작은 주걱이나 접힌 무게 종이로 입자를 들고, 그리고 태아의 각 시리즈를위한 튜브에 그들의 약 절반을로드합니다. 균일 입자를 확산하기 위해 로딩 단계 동안 튜빙을 누릅니다.
4. 동물 준비
골드 입자 전달 전후의 배아는 실온에서 무균 인공 연못 물에 보관됩니다.
- 실리콘 고무 (Sylgard 184, 다우 코닝, 미들랜드, MI)의 평면, 5mm 두께의 조각에 새겨진 홈에, 최대 배아, 복부 측면을 놓고 (무균 인공 연못 물에 8 %의 에탄올의 솔루션을 마취시키다 단계 E6 - E8에서 젊은 배아)은 실험을하는 동안 노 에탄올과 인공 연못 물에 남아있을 수 있습니다.
- 즉시 입자를 촬영하기 전에이 솔루션의 일부를 제거하여 태아의 복부 표면을 밝히기 위해서 목욕 수준을 낮추십시오. 그것을 안정화하고 건조로부터 표면을 유지하는 그것의 상단에있는 중간에 잘라 작은 구멍과 함께 조직 종이를 놓습니다.
5. 대상 조직으로 코팅 입자의 딜리버리
입자 중 하나는 부하는 일반적으로 하나의 촬영은 보통 몇 백 입자의 순서에 전달과 함께 최대 10 발이에 사용할 수 있습니다.
- 총에 해당 튜브 라인에서 입자의 볼러스의 주입을 초래 0.3 s에 대한 밸브 중 하나를 열어 주사를 생성합니다.
- 튜브의 벽에서 입자를 이동시키다하기 때문에 총을의 그 흐름에 자신의 주사를 촉진하는 장면 사이에 부드럽게 튜빙을 누릅니다.
- 관심 조직의 영역을 커버하기 위해 여러 장면이 필요할 수 있습니다.
- 입자 배달 후 다중 잘 플레이트의 인공 연못의 물, 잘마다 선호 하나 배아로 배아를 다시 넣으십시오.
6. 단백질얼룩과의 연결 라벨
RNAi (또는 이소성 표현) 달성 때까지 입자 전달 후 1~3일에 대한 실온에서와 어둠의 배아 보관하십시오. 우리는 다음 실험 표본 및 컨트롤에서 다음 절차 중 하나를 수행 :
- Netrin의 mRNA의 존재 또는 부재에 대한 분석으로 원위치 하이브리드화에. Digoxigenin - 표시 리치 netrin의 riboprobes는 전체 리치 배아에 hybridized입니다.
- Netrin 단백질과의 연결 조직 (예 : 안티 acetylated tubulin)에 고유한 다른 단백질에 대한 분석을 Immunocytochemistry. 절차는 전체 마운트 배아에서도 수행됩니다.
- 치료 및 제어 분야에 대한 관심의 뉴런 (우리의 경우 mechanosensory 압력 뉴런)의 전체 아보스 레이블을하는 염료는 - 채웁니다 하나의 뉴런으로 lipophilic 염료 (DiI 및 DIO)의 Microinjections. 이 분석은 라이브 배아 (손상 또는 해부)에 수행됩니다.
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Discussion
이 예제에서, 우리는 안으로 안으로 살고 리치 배아의 작은화된 볼륨에있는 세포에 금 입자를 제공하고 유전자를 다운 노크 공압 모세관 총을를 사용합니다. 대상 지역은 일반적으로의 직경을했다 ~ 150 μm의 및 입자가 발견되면 0과 50 μm의 사이에 조정했던 의미 침투 깊이 주변 ~ 15 μm의. 입자가 축삭지도 팩터 netrin의 dsRNA 분자로 코팅 때, 그들은 분명만을 입자를 포함하는 세포에서 발생 netrin 표현의 노크 다운 표시가 발생했습니다. 입자들이 핵에 정지의 연결을 세포에 플라스미드 인코딩 GFP 유도 형광 코팅.
공압 모세관 총을 조직에 손상을 감지하지 않고, 3 차원에 갇혀 높은 정밀도와 함께 타겟으로하는 조직의 미세한 지역을 대상으로, biolistic 배달의 기술에 새로운 기능을 제공하는 방법 우리는 당신을 보여주었다.
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Acknowledgments
우리는 티가과 성장 감각 예측의 시간 경과 영화를 제공하는 유전자에 대한 구조를 생성하는 그의 도움 마이클 베이커 감사드립니다. 우리는 또한 공압 총기 실험과 기술 지원 버지니아 Vandelinder 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
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- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
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