Summary
I denna video visar vi ett förfarande för en korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad med en ny miniatyr gen pistol. Vi knackar ner ett uttryck för axonet vägledning molekylen Netrin i akterliket embryon genom att leverera molekyler av dsRNA i ventrala kroppen väggen och ganglier av enstaka segment.
Abstract
I denna video visar vi användning av en pneumatisk kapillär pistol för korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad. Vi använder förfarandet för att störa mönster genuttryck i utvalda segment av blodigel embryon, lämnar obehandlade segment som intern kontroll.
Den pneumatiska kapillära pistolen kan användas för att nå interna lager av celler i tidiga stadier av utveckling utan att öppna provet. Som en metod för lokal införande av ämnen i levande vävnader, har biolistic leverans med pistolen flera fördelar: den är snabb, beröringsfri och oförstörande. Dessutom kan en enskild kapillär pistol användas för oberoende leverans av olika ämnen. Leveransen region kan ha laterala mått ~ 50-150 ìm och sträcker sig över ~ 15 ìm kring medelvärdet penetrationsdjupet, som är inställbart mellan 0 och 50 ìm. Denna leverans har fördelen av att kunna rikta ett begränsat antal celler i en vald plats mellanting mellan enskild cell slå ner genom mikroinjektion och systemiska knockdown genom extracellulära injektioner eller med hjälp av genetiska metoder.
För knackar ner eller knackar i uttryck av axonet vägledning molekylen Netrin, vilket naturligtvis uttrycks av några centrala neuron och i den ventrala kroppen väggen, men inte rygg-domänen, vi levererar molekyler av dsRNA eller plasmid-DNA i kroppen väggen och centrala ganglierna. Detta förfarande omfattar följande steg: (i) utarbetande av experimentuppställning för en specifik analys (justering av den accelererande trycket), (ii) beläggning partiklarna med molekyler av dsRNA eller DNA, (iii) Laddar den belagda partiklar i pistolen, upp till två reagenser i en analys, (iv) förbereda djur för partikeln leverans, (v) leverans av belagda partiklar i målvävnad (body vägg eller ganglier), och (vi) behandla embryon (immunfärgning, immunohistokemi och neuronala märkning) för att visualisera resultaten, vanligtvis 2 till 3 dagar efter leverans.
När partiklarna var belagd med netrin dsRNA orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara skett i celler som innehåller partiklar (vanligtvis 1-2 partiklar per cell). Partiklar belagd med en plasmid kodning EGFP inducerad fluorescens i neuronala celler när de stannade i sina kärnor.
Protocol
Partiklar kan vara belagd med olika reagens, såsom dsRNA molekyler, plasmider DNA eller färgämnen. Den typ och diameter av partiklar väljs beroende på reagens och djupet av målet celler i vävnad: större partiklar tränger vidare, men kan orsaka skador på vävnaden.
1. Beredning av dsRNA belagda partiklar
- Häll 100% isopropanol på is.
- Resuspendera 5 mg guldpartiklar (S1600ri, Seashell Technology, LLC, medeldiameter 1,6 mikrometer) i 100 ml bindande buffert. När lösningen är färdig, gå vidare till nästa steg.
- Späd partikeln lösningen genom att tillsätta 100 l av bindande buffert, vortex kort och Sonikera 1-2 minuter för att undvika klumpar.
- Tillsätt 5-10 mikrog dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA ska lösas upp i vatten till en koncentration av ~ 1μg/μl).
- Vortex och låt stå i rumstemperatur i 2 min. Dessa koncentration och tidsintervall resultera i siRNA mättade guld partiklar.
- Pelletera siRNA / guld partikel komplex genom centrifugering vid ~ 2500 rpm i en bänk centrifug för ~ 15 sek.
- Avlägsna supernatanten och försiktigt lägga 750 ml kallt isopropanol med minimala störningar av pelleten. Spin kort och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera guldpartiklar i 100 l kalla 100% isopropanol, sedan Sonikera kort i ett bad sonicator (2-3 pulser) för att bryta upp partikel agglomerat. Senast, häll svävande partiklar på en glasskiva och låt torka i rumstemperatur.
2. Förbereda experimentuppställning för en specifik analys
- Varje pistol har en annan diameter munstycke bländare, allt från ett minimum av ~ 50μm upp till ~ 3mm. Det specifika som ska användas för vapnet är därför valt beroende på vilket område av vävnad att vara målinriktad.
- Den Han trycket är justerat för djupet i vävnaden av målceller, i allmänhet upp till ~ 100μm (högre tryck kan leverera partiklar djupare). Avståndet mellan embryot och spetsen av munstycket påverkar också penetrationsdjup som guldpartiklar löst fart i luft.
3. Laddar pistolen med före-belagda partiklar
Partiklar ska läsas in som ett torrt pulver i partikeln tygon slangen injektion anslutna till fördelaren. Denna slang, som bör förvaras i en torr atmosfär vid 4 ° C när den inte används, kan återanvändas i ytterligare experiment med samma reagens. Vår experimentuppställning kan leverera upp till två olika reagens per analys genom separata hamnar i grenröret.
- Skrapa torkade belagda partiklar från glaset bilder med hjälp av kanten på en glaskupa halka eller ett rakblad innan du lägger dem i tygon slangen linjen. Detta tygon slang kommer endast specifika för denna reagens för att undvika korskontaminering.
- När du laddar partiklarna, böj slangen i ett U nära kontakt, för att hålla partiklar sprids längs hela slangen och koncentrerade nära kontakt. Plocka upp partiklarna med en liten spatel eller en bit vikt väger papper, och ladda ungefär hälften av dem i slangen för varje serie av embryon. Tryck på slangen under lastning steget att sprida partiklar jämnt.
4. Animal Förberedelser
Före och efter guldet partikeln leverans är embryona förvaras i sterila konstgjord damm vatten vid rumstemperatur.
- Placera embryon, ventrala uppåt, i ett spår ristade in i en lägenhet, 5mm tjock bit silikongummi (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) och söva ner dem i en lösning av 8% etanol i sterilt konstgjorda dammen vatten ( yngre embryon de led E6-E8 kan finnas kvar i konstgjorda dammen vatten med ingen etanol i hela experimentet).
- Omedelbart före fotografering partiklar, lägre badet nivå för att avslöja ventrala yta av embryon genom att ta bort en del av lösningen. Lägg en bit vävnad papper med ett litet hål skära i mitten på toppen av det för att stabilisera den och för att hålla sin yta från att torka.
5. Leverans av belagda partiklar i målvävnad
En belastning av partiklar kan normalt användas i upp till tio skott, med ett enda skott brukar leverera på order av några hundra partiklar.
- Skapa ett skott genom att öppna en av ventilerna för 0,3 s, vilket gör att injektion av en bolusdos av partiklar från motsvarande slangen linjen i pistolen.
- Tryck slangen försiktigt mellan skotten för att lossa partiklar från slangen väggen och därmed underlätta deras injektion i Han ström av vapnet.
- För att täcka det område av vävnad av intresse, kanske flera skott krävas.
- Efter partikel leveransen, placera embryon tillbaka i konstgjorda dammen vatten, helst ett embryo per brunn i en multi-brunnar.
6. Immunofärgning och neuronala märkning
Håll embryon i rumstemperatur och i mörker i 1 till 3 dagar efter partikeln leverans, tills RNAi (eller ektopisk uttryck) uppnås. Vi utför sedan ut en av följande procedurer på experimentella prover och kontroller:
- In situ hybridisering till analys för närvaro eller frånvaro av Netrin mRNA. Digoxigenin-märkta blodigel netrin riboprobes är hybridiseras till hela akterliket embryon.
- Immuncytokemi till analys för Netrin protein och andra proteiner som är unika för neuronal vävnad (t.ex. anti acetylerade tubulin). Ingreppet görs också på hela montering embryon.
- Microinjections av lipofila färgämnen (DII och DIO) i enstaka nervceller, för dye-fyller att märka hela hållare av nervceller av intresse (mechanosensory tryck nervceller i vårt fall) i behandlade och kontroll segment. Denna analys utförs på levande embryon (intakt eller dissekeras).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna demonstration använde vi den pneumatiska kapillär pistolen för att leverera guldpartiklar till celler i små lokaliserade volymen av en levande blodigel embryo till knock-in och knock-down gener. Målet regionen hade generellt en diameter på ~ 150 ìm och partiklar hittades ~ 15 ìm kring medelvärdet inträngningsdjup, som var inställbart mellan 0 och 50 ìm. När partiklarna var belagda med dsRNA molekyler av axonet vägledning faktorn netrin, orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara förekommit i celler som innehåller partiklar. Partiklar belagd med en plasmid kodning GFP inducerad fluorescens i neuronala celler när de stannade i sina kärnor.
Vi har visat dig hur pneumatiska kapillära pistolen ger tekniken biolistic leverans en ny funktion, för att rikta mikroskopiska delar av en vävnad begränsas i tre dimensioner och riktade med hög precision, utan påvisbar skada på vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Michael Baker för hans hjälp i att skapa konstruktioner för gen knock-in och för att tillhandahålla tidsförlopp filmer av växande sensoriska prognoser. Vi vill också tacka Virginia Vandelinder för tekniskt bistånd med experimenten tryckluftspistol.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
