Biology

Одноместный Электропорация сотовых в естественных условиях в течение Неповрежденный развивающийся мозг

Published: July 11, 2008 doi: 10.3791/705

D. Sesath Hewapathirane^1,2, Kurt Haas^1,2

¹Brain Research Centre, University of British Columbia - UBC, ²Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia - UBC

Summary

Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Здесь мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми Xenopus laevis головастика.

Abstract

Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Явное преимущество этого метода в том, что экспериментальные манипуляции могут быть выполнены на отдельные клетки, оставляя окружающую ткань без изменений, тем самым проводя различие клеточной автономных эффектов от тех, в результате глобального лечения. В сочетании с передовыми в естественных методов визуализации, SCE флуоресцентных маркеров позволяет прямой визуализации клеточной морфологии, рост клеток и внутриклеточных событий за сроки от нескольких секунд до нескольких дней. Хотя эта техника используется в разнообразных в естественных условиях и экс подготовки естественных условиях, мы оптимизировали эту технику для использования в Xenopus laevis головастиков. В этом видео статье мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми альбиноса Xenopus головастика. Мы также обсудим методы для оптимизации доходности и показать примеры жить двухфотонной флуоресценции нейронов флуоресцентно помеченных SCE.

Protocol

Оборудование установки:

Электротехническое оборудование, необходимое для этой техники стимулятор, осциллограф, и микропипетки держатель оснащен серебряную проволоку для вставки в микропипетки. Обычно мы используем инструменты Axon Axoporator 800A стимулятор, однако другие общие стимуляторы, такие как трава инструментов SD9 стимуляторы, также пригодны для одноклеточных электропорации. Стимулятор подключен к headstage, который взаимодействует с электродом серебряной проволоки, чтобы быть помещен внутрь стеклянной микропипетки содержащих внутренние проведении решение. Другие ведут от стимулятора подключен к входной осциллографа, который также получает данные от внешних головастика землю. Головастика внешних землю просто серебряной проволоки, которая остается в контакте с электротонических головастика во время электропорации. Схема полного раз микропипетки находится в контакте с головастика.
Одноместный электропорации клетка требует микроскоп с хорошим рабочим расстоянием (по крайней мере 5 см), так как это дает пространство для маневра и позволяет микропипетки быть приведены в под углом примерно 30-45 градусов.

Изготовление микропипетки:

Подготовка соответствующих микропипетки является важным шагом в этом протоколе. Трудность заключается в балансировании узкий наконечник (менее 1 мкм в диаметре) с тем, который не будет легко ломаются, когда прокола ткани. Мы также обнаружили, что советы с коническим углом более 10 градусов, предпочтительнее.

Подготовка вытащил стекло микропипетки с диаметром кончика менее 1 мкм, а угол кончика конусность превышает 10 градусов.
1. Боросиликатного стекла с внутренней нити с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,75 мм хорошо подходит для этой цели.
  1. Относительно толстые стекла обеспечивает степень жесткости к кончику.
  2. Внутренние нити важно при составлении обратно заполненные жидкостью к кончику микропипетки.
Изготовление подходящих советов, которые могут потребовать нескольких модификациях на основе полученных результатов. Различные ткани может потребовать наконечник с немного другой формы или диаметр кончика.

Одноклеточный электропорации протокола:

Для новых пользователей, то целесообразно начинать с флуоресцентными красителями декстран, поскольку, в отличие от генетически закодированы флуоресцентных белков, их можно сразу же увидеть под epifluorescence. Использование флуоресцентных красителей позволяет пользователю непосредственно видеть расположение микропипетки на высоту не более тканей, и на электропорация дает мгновенную обратную связь относительно того, что оборудование было правильно настроить и будет ли кончика микропипетки является целесообразным.

Заполните микропипетки с решением соединения на электропорации либо с помощью загрузки шприца или восполнения.
1. При использовании ДНК плазмиды, убедитесь, что образцы эндотоксина свободной и концентрации между 1-2μg/ml, подготовленный в воде.
2. Концентрация флуоресцентных красителей декстрана должны быть определены эмпирически. Мы часто используем флуоресцентными красителями, разбавленным водой примерно до 300μM.
3. Как правило, объемы 0.5-1 мкл достаточно.
4. Перед загрузкой, кратко центрифуги решения с высокой скоростью, чтобы уменьшить количество частиц мусора вовлечены в микропипетки, что может привести к засорению.
5. Пузырьки воздуха в наконечник часто влияют на ток и должны быть выбиты энергично стряхивая микропипетки до монтажа на headstage.
Вставьте в держатель микропипетки или headstage установлен на 3-х осевой микроманипулятора. Убедитесь, что электрод серебряной проволоки вставляется в микропипетки, и находится в контакте с электротонических внутреннее решение.
Обезболить головастиков путем погружения в 0,02% MS-222 (3-аминобензойной кислоты этиловый эфир), подготовленный в головастика средой воспитания (раствор Стейнберга, рН 7,4).
1. Мы обычно используем стадии 44-48 альбиносы Xenopus laevis головастиков в наших экспериментах.
2. Головастики, как правило, полностью под наркозом после примерно 5 минут.
3. Несколько головастиков может быть под наркозом одновременно сократить времени ожидания, однако, избегать контакта с MS-222 на период после 1 часа.
Передача одного наркоза головастика до электропорации камеры использованием пластиковых микропипетки передачи.
1. Электропорации камеру можно легко сделать в доме резьбы головастика формы полости в небольших Sylgard ® силиконовых блоков и вставки серебряной проволоки землю в полости такова, что она будет находиться в контакте с электротонических головастика в камере.
Позиция головастика спинной стороны с использованием смоченной кистью.
Нижняя микропипетки, пока он находится в контакте с кожей, непосредственно примыкающих к области интересов.
1. Ориентация на регионы с плотно упакованными органов клетка значительно повысит шансы на успешное электропорации.Как правило, мы целевой головастика оптических покрышки.
2. Принесите микропипетки под углом от 30 до 45 градусов. Меньшую траектории сделать кожу прокол сложнее, а круче углы зачастую препятствуют своим видом.
Продолжение снижения микропипетки первоначально будет углубление кожи, а затем пройти в основную ткань.
1. Поверхностные клетки являются предпочтительными для прижизненного изображения, и могут быть направлены на обеспечение того, чтобы кончик микропипетки медленно опускается на рябь кожи.
Надо постоянно следить за микропипетки сопротивление раз помещен в ткани. При использовании Axoporator 800A (Axon Instruments), сопротивления около 10-40мОм являются оптимальными. Сопротивление является хорошим индикатором того, диаметр кончика подходит для одноклеточных электропорации.
1. Высокое сопротивление микропипетки (> 100 МОм), свидетельствуют о забитых советы микропипетки с советами, которые являются слишком узкими.
2. Низкое сопротивление микропипетки (<10 МОм) указывают на диаметр кончика, который является слишком большим, часто в результате сломанный наконечник.
3. При использовании стимулятора, который не обеспечивает прямое измерение сопротивления, микропипетки сопротивление может косвенно измеряется путем наблюдения амплитуды импульсов напряжения измеряется осциллографа (см. ниже).
Применить напряжения поезда.
1. Для ДНК плазмиды, импульсов оказалась наиболее эффективной состоят из отрицательных прямоугольных импульсов волны 1 мс в срок, сделанное на 300Hz с импульсов длительностью 500 мс.
  1. Импульса напряжения определяется эмпирически, что амплитуды импульсов, измеренных на осциллограф между 0,75 и 1.5μA.
2. Для флуоресцентных красителей декстран, положительные прямоугольные импульсы волна 300μs продолжительность поставляются на частоте 300 Гц с импульсов длительностью 10 мс.
  1. Как и протокол для ДНК, импульса напряжения определяется эмпирически, что амплитуды импульсов, измеренных на осциллограф между 0,75 и 1.5μA.
  2. Дополнительные корректировки стимул параметры могут быть сделаны на основе наблюдений результаты электропорации под epifluorescence.
    1. Если электропорации клетки появляются тусклые, параметры импульсов должны быть постепенно увеличена до клетки появляются ярче.
    2. С другой стороны, если кластеры клеток, помечены, параметры импульсов должны быть сокращены до одной клетки помечены.
Уберите микропипетки, повторно вставить в другое место в пределах тканей, и применять напряжение поезд.
1. Для повышения урожайности, мы обычно electroporate нескольких сайтах в каждом полушарии головастика оптических покрышки с достаточным расстоянием, чтобы меченых клеток не перекрываются.
Передача электропорации головастика в контейнере с воспитанием решение Стейнберга.
1. Головастики быстро оправиться от наркоза в течение нескольких минут.
Микропипетки же может быть использован для многочисленных головастиков. Важно постоянно наблюдать амплитуды импульсов наблюдается на осциллографе.
1. Если амплитуда импульса остается на низком уровне после значительного увеличения интенсивности импульса это, вероятно, в результате засорения наконечника, часто видели, когда electroporating много головастиков в один присест.
  1. Метод выбить незначительных забивают наконечник должен применяться один положительный импульс после вставки микропипетки в ткань.
  2. Если забивать не могут быть смещены или засорение часто повторяется, замените микропипетки.
2. Если амплитуда импульса остается очень большим после значительного снижения параметров импульса, это признак того, что кончик сломался и его необходимо заменить.

Скрининг для успешного электропорации клеток:

После электропорации, головастиков, проверяются на меченых клеток с использованием вертикально epifluorescence микроскопом.
В случае с флуоресцентными красителями, головастиков могут просматриваться после всего лишь 30 минут после электропорации.
1. Мы нашли, однако, что более длительные интервалы связаны с более низким уровнем фона флуоресценции.
Для генетически закодированы флуоресцентные белки, обследование обычно проводится в течение 12 часов после электропорации.
1. Клетки, экспрессирующие флуоресцентных белков будет продолжать становиться ярче с течением времени, поэтому тусклый клетки могут быть повторный скрининг после дополнительного интервалом 12-24 часов.
Головастики анестезируют, как описано выше, размещенных в Sylgard ® камеры и coverslipped. Индивидуальные головастиков, затем рассматривается в соответствии с epifluorescence.
1. Обратите внимание, что чрезмерное воздействие света epifluorescence приведет фототоксичности, которые могут убить меченых клеток. Таким образом, свести к минимуму количество времени, что клетки подвергаются воздействию дневного света.
Вернуться головастиков в контейнер с воспитанием решение Стейнберга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Одноклеточный электропорации (SCE) является мощным инструментом для определения функций генов и выполнение целевых генетических манипуляций. Прозрачность альбиноса головастика и доступности мозга делают эту модель системы идеально подходят для визуализации нейронных роста и внутриклеточных событий в живой организм. SCE позволяет визуализировать рост одного нейрона, а также для выполнения автономных клеточных манипуляций в противном случае неизменным мозга. Хотя эта статья демонстрирует видео процедура одноклеточных электропорации в Xenopus laevis головастиков, эта техника была использована и в других организмов, а также используется в срезах гиппокампа и диссоциированных культурах клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Шармин Хоссейн для покадровой съемки фильма рост незрелых нейронов и Дерек Данфилд для электронных изображений микроскопии SCE советы micromicropipette.

References

Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).
Dunfield, D., Haas, K. Single cell electroporation. Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.
Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).