وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Summary

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح تسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. نحن هنا من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليمة من الشرغوف القيطم المورق.

Abstract

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح للتسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. ميزة متميزة من هذه التقنية قد يتم تنفيذ هذا التلاعب التجريبية على الخلايا الفردية بينما تترك الأنسجة المحيطة دون تغيير ، وبالتالي التمييز بين الخلايا من آثار الحكم الذاتي تلك الناجمة عن العلاج العالمية. عند دمجها مع تقنيات التصوير المتطورة في الجسم الحي ، SCE علامات الفلورسنت تصاريح التصوير المباشر للمورفولوجيا الخلوية ، ونمو الخلايا ، والأحداث داخل الخلايا على فترات زمنية تتراوح ما بين ثانية لأيام. بينما يتم استخدام هذه التقنية في مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية في فيفو فيفو والسابقين ، ونحن هذا الأسلوب الأمثل لاستخدامها في الشراغف القيطم المورق. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليمة من الشرغوف القيطم البيضاء. نناقش أيضا أساليب لتحسين الإنتاجية ، وتبين الأمثلة التصوير ثنائي الفوتون مضان يعيش من الخلايا العصبية التي fluorescently المسمى SCE.

Protocol

معدات انشاء :

1. المعدات الكهربائية اللازمة لهذه التقنية هي محفز ، الذبذبات ، حتى أن صاحب micropipette مزودة بسلك الفضة لإدراجها في micropipette. عادة ما نستخدم الأدوات أكسون Axoporator 800A مشجعا ، ولكن التحفيز والتشجيع المشتركة الأخرى مثل الصكوك غراس SD9 التحفيز والتشجيع هي أيضا مناسبة لوحيدة الخلية electroporation. توصيل منشط للheadstage ، والتي واجهات مع سلك كهربائي الفضة لتوضع داخل micropipette الزجاجية التي تحتوي على حل داخلي إجراء. توصيل تؤدي غيرها من منشط للمدخلات الذبذبات ، الذي يتلقى أيضا مدخلات من الأرض الخارجية الشرغوف. الأرض الشرغوف الخارجي هو مجرد اسلاك الفضة التي لا تزال على اتصال مع تيار كهربي خلال الشرغوف electroporation. اكتمال الدائرة مرة واحدة يتم وضع micropipette في اتصال مع الشرغوف.
   
   
2. وحيد الخلية electroporation يتطلب المجهر مع مسافة عمل جيدة (على الأقل 5cm) ، لأن هذا يعطي مجالا للمناورة ويسمح في جلب micropipette بزاوية 30-45 درجة تقريبا.

تلفيق micropipettes :

إعداد micropipettes المناسب هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. وتكمن الصعوبة في تحقيق التوازن بين تلميح الضيقة (أقل من 1μm في القطر) مع واحد التي لن كسر بسهولة عندما ثقب الأنسجة. وقد وجدنا أيضا أن النصائح بزاوية تفتق أكبر من 10 درجة هي الأفضل.

1. إعداد micropipette الزجاج وسحبت التي يبلغ قطرها أقل من غيض من 1μm ، وزاوية تفتق غيض من أكبر من 10 درجة.
   1. هي مناسبة تماما الزجاج البورسليكات مع خيوط داخلية مع القطر الخارجي والداخلي قطرها 1.5mm 0.75mm من أجل هذا الغرض.
      1. زجاج سميك نسبيا يوفر درجة من الصلابة إلى الحافة.
      2. خيوط الداخلي هو المهم في الرسم مرة أخرى مليئة السائل نحو غيض micropipette.
2. وتلفيق من النصائح المناسبة وغالبا ما تتطلب تعديلات عدة على أساس النتائج الملاحظة. قد تتطلب الأنسجة المختلفة تلميح مع شكل مختلف قليلا أو القطر تلميح.

وحيدة الخلية electroporation البروتوكول :

للمستخدمين الجدد ، فإنه من المستحسن أن تبدأ مع الأصباغ الفلورية ديكستران منذ ذلك الحين ، على عكس البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا ، يمكن أن ينظر مباشرة تحت epifluorescence. استخدام الأصباغ الفلورية تمكن المستخدم من رؤية مباشرة من موقع الطرف micropipette داخل الأنسجة ، وبناء على ردود الفعل الفورية electroporation يعطي ما إذا كان قد تم تعيين بشكل صحيح حتى المعدات وعما إذا كان الطرف micropipette مناسبا.

1. ملء micropipette مع حل المجمع ليكون electroporated إما باستخدام حقنة التحميل أو عن طريق ملء الخلفي.
   1. إذا باستخدام الحمض النووي البلازميد ، وضمان أن العينات خالية من الذيفان الداخلي ، وعلى التركيز بين 1-2μg/ml ، الذي أعد في الماء.
   2. وينبغي تركيز الأصباغ الفلورية ديكستران العزم تجريبيا. نحن غالبا ما تستخدم الأصباغ الفلورية المخفف في الماء ل300μM تقريبا.
   3. عادة ، وكميات من 1μl - 0.5 كافية.
   4. قبل التحميل ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الحلول بسرعة عالية للحد من كمية الحطام في رسمها الجسيمات micropipette ، والتي قد تؤدي إلى انسداد.
   5. فقاعات الهواء داخل تلميح غالبا ما تؤثر على تدفق الحالية ، وينبغي أن طردتهم عبها بقوة micropipette قبل تصاعد على headstage.
2. إدراج micropipette إلى صاحب المركبة أو headstage micromanipulator على 3 محاور. ضمان أن يتم إدخال سلك كهربائي في micropipette الفضة ، وعلى اتصال مع تيار كهربي الحل الداخلي.
3. تخدير الضفادع الصغيرة عن طريق الغمر في 0.02 ٪ MS - 222 (3 - أمينوبنزويك حمض إيثيل استر) التي أعدت في المتوسط ​​تربية الشرغوف (حل شتاينبرغ ، ودرجة الحموضة 7.4).
   1. نستخدم عادة مرحلة 44-48 البيضاء القيطم المورق الضفادع الصغيرة في تجاربنا.
   2. وعادة ما تكون الضفادع الصغيرة تخدير كامل بعد حوالي 5 دقائق.
   3. الشراغف عدة في وقت واحد قد يكون تخدير للحد من الانتظار الوقت ، ومع ذلك ، وتجنب التعرض لMS - 222 لفترات تتجاوز 1 ساعة.
4. نقل الشرغوف تخدير واحد لغرفة electroporation باستخدام micropipette نقل من البلاستيك.
   1. يمكن أن تكون الغرفة التي electroporation بسهولة في المنزل من خلال تجويف نحت على شكل الشرغوف في Sylgard ® سيليكون صغيرة الكتلة ، وإدخال سلك الأرض الفضة في تجويف هذه أنه سيكون على اتصال مع تيار كهربي الشرغوف في الغرفة.
5. مبلل موقف الجانب الظهري الشرغوف حتى باستخدام فرشاة الرسم.
6. انخفاض micropipette حتى أنه في تماس مع الجلد ، المتاخمة مباشرة للمنطقة من الفائدة.
   1. وسوف تستهدف المناطق ذات أجسام الخلايا المكتظ زيادة كبيرة في فرص نجاح electroporation.نحن الهدف عادة سقف الشرغوف البصري.
   2. جلب micropipette في بزاوية 30 إلى 45 درجة. ضحالة مسارات جعل ثقب الجلد أكثر صعوبة ، في حين كثيرا ما تعوق انحدارا زوايا عرض واحد.
7. وسوف يخفض استمرار micropipette رصعة في الجلد في البداية ، ثم تمر عبر في النسيج الأساسي.
   1. ويفضل الخلايا السطحية للتصوير في الجسم الحي ، ويمكن أن تكون مستهدفة من خلال ضمان أن يتم تخفيض رأس micropipette ببطء على التنقير من الجلد.
8. ينبغي للمرء أن يرصد باستمرار المقاومة micropipette توضع مرة واحدة داخل الأنسجة. إذا باستخدام 800A Axoporator (أكسون صكوك) ، المقاومة ما يقرب من 10 40MΩ هي الأمثل. المقاومة هي مؤشر جيد على ما إذا كان القطر تلميح غير مناسبة وحيدة الخلية electroporation.
   1. المقاومات micropipette عالية (> 100MΩ) تدل على نصائح أو انسداد micropipettes مع النصائح التي هي ضيقة للغاية.
   2. المقاومات micropipette منخفضة (<10MΩ) تدل على أن الطرف قطرها كبير جدا ، وغالبا نتيجة لطرف المكسور.
   3. إذا باستخدام منشط لا توفر مقياسا المقاومة مباشرة ، ويمكن قياسها بشكل غير مباشر من خلال مراقبة micropipette المقاومة اتساع النبضات الجهد يقاس الذبذبات (مناقشته أدناه).
9. تطبيق تدريب الجهد.
   1. لDNA البلازميد والقطارات وجدت النبض لتكون أكثر فعالية تتكون من نبضات موجة سلبية في مربع 1ms المدة ، وألقيت في 300Hz مع فترة تدريب نبض 500ms.
      1. يتم تحديد مثل هذا الجهد نبض تجريبيا أن السعة من البقول قياس الذبذبات على ما بين 0.75 و 1.5μA.
   2. لديكستران الأصباغ الفلورية ، يتم تسليم إيجابية البقول موجة مربعة لمدة 300μs على تردد 300Hz مع فترة تدريب نبض 10ms.
      1. كما هو الحال مع بروتوكول للالحمض النووي ، ويتم تحديد مثل هذا الجهد نبض تجريبيا أن السعة من البقول قياس الذبذبات على ما بين 0.75 و 1.5μA.
      2. ويمكن إجراء تعديلات إضافية لتحفيز المعلمات على أساس مراعاة نتائج electroporation تحت epifluorescence.
         1. إذا الخلايا electroporated تظهر قاتمة ، ينبغي المعلمات نبض تدريجيا حتى تظهر الخلايا أكثر إشراقا.
         2. من ناحية أخرى ، إذا وصفت مجموعات من الخلايا ، ينبغي تخفيض المعلمات نبض حتى تتم تسمية الخلايا واحد.
10. التراجع micropipette ، في موقع مختلف داخل النسيج إعادة إدراج ، وتطبيق تدريب الجهد.
    1. لتحسين الإنتاجية ، ونحن عادة electroporate مواقع متعددة في كل من نصف الكرة سقف البصري الشرغوف مع تباعد كافية لضمان أن الخلايا المسمى لا تتداخل.
11. نقل الشرغوف electroporated في وعاء مع الحل للتربية شتاينبرغ.
    1. سوف يتعافى بسرعة من الضفادع الصغيرة التخدير في غضون دقائق قليلة.
12. يمكن استخدام نفس micropipette الشراغف عديدة. ومن المهم أن نلاحظ باستمرار اتساع النبضات الملاحظة على الذبذبات.
    1. إذا كانت السعة نبض لا يزال منخفضا بعد زيادة كبيرة في شدة النبضة هذا من المحتمل أن يكون نتيجة لانسداد تلميح يجري ، غالبا ما ينظر إليها عند electroporating الشراغف كثيرة في جلسة واحدة.
       1. وهناك طريقة لطرد a تسد طرف القاصر لتطبيق نبضة واحدة ايجابية بعد إدراج micropipette في الأنسجة.
       2. إذا لا يمكن أن تسد فكها ، أو انسداد يتكرر في كثير من الأحيان ، استبدال micropipette.
    2. إذا كان لا يزال نبض السعة الكبيرة جدا بعد انخفاض كبير في المعلمات نبض ، وهذا هو إشارة إلى أن الطرف قد كسر ويحتاج إلى استبداله.

الكشف عن خلايا electroporated بنجاح :

1. بعد electroporation ، يتم فحص لخلايا الشراغف المسمى باستخدام المجهر تستقيم epifluorescence.
2. في حالة من الأصباغ الفلورية ، قد يتم فرزهم الشراغف بعد اقل من 30 دقيقة بعد electroporation.
   1. لقد وجدنا ، مع ذلك ، أن ترتبط فترات أطول مع انخفاض مستويات مضان الخلفية.
3. البروتينات الفلورية للترميز وراثيا ، ويجرى الفحص عادة 12 ساعة على الأقل بعد electroporation.
   1. وأعرب عن الخلايا البروتينات الفلورية الاستمرار في الحصول على اكثر اشراقا مع مرور الوقت ، وبالتالي قد تكون الخلايا قاتمة اعادة فرزهم بعد فترة من 12-24 ساعة إضافية.
4. يتم تخدير الضفادع الصغيرة على النحو الموصوف أعلاه ، وضعت في غرفة ® Sylgard وcoverslipped. ثم يتم فحص الشراغف الفردية بموجب epifluorescence.
   1. علما أن التعرض المفرط لضوء epifluorescence سينتج الضيائية التي قد تقتل الخلية المسمى. لذلك ، تقليل مقدار الوقت الذي تتعرض الخلايا لضوء الفلورسنت.
5. عودة إلى حاوية مع الشراغف حل للتربية شتاينبرغ.

Discussion

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هو أداة قوية لتحديد وظائف الجينات وأداء التلاعب الجيني المستهدفة. الشفافية في الشرغوف البيضاء وسهولة الحصول على الدماغ تجعل هذا النظام نموذجا مثاليا لنمو الخلايا العصبية وتصور الأحداث داخل الخلايا كائن حي. SCE يسمح التصور من نمو الخلايا العصبية واحد ، وعلى أداء الخلايا ذاتي التلاعب داخل الدماغ دون تغيير على خلاف ذلك. في حين أن هذا المقال يوضح الفيديو إجراء وحيد الخلية في electroporation القيطم المورق الضفادع الصغيرة ، وقد استخدمت هذه التقنية في الكائنات الحية الأخرى ، واستخدمت أيضا في شرائح الحصين والثقافات الخلية فصلها.