תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Summary

תא בודד electroporation (SCE) היא טכניקה מיוחדת המאפשרת משלוח של ה-DNA או מקרומולקולות אחרים לתוך תאים בודדים בתוך הרקמה בשלמותה, כולל ההכנות vivo. כאן אנו בפירוט את הליך SCE של פלורסנט לצבוע או פלסמיד דנ"א לתוך הנוירונים במוח שלם של laevis Xenopus הראשן.

Abstract

תא בודד electroporation (SCE) היא טכניקה מיוחדת המאפשרת העברה של דנ"א או מקרומולקולות אחרים לתוך תאים בודדים בתוך הרקמה בשלמותה, כולל ההכנות vivo. היתרון הברור של שיטה זו הוא כי מניפולציות הניסוי עשוי להתבצע על תאים בודדים תוך השארת הרקמה שמסביב ללא שינוי, ובכך להבדיל תאים אוטונומיים תופעות הנובעות מאותם טיפולים העולמי. בשילוב עם טכניקות מתקדמות vivo הדמיה, SCE של סמנים ניאון היתרי להדמיה ישירה של מורפולוגיה הסלולר, גדילת התאים, והאירועים תאיים על לוחות הזמנים החל שניות ימים. בעוד טכניקה זו משמשת במגוון in vivo וההכנות vivo לשעבר, יש לנו אופטימיזציה טכניקה זו לשימוש הראשנים Xenopus laevis. במאמר זה וידאו, אנחנו בפירוט את הליך SCE של פלורסנט לצבוע או פלסמיד דנ"א לתוך הנוירונים במוח שלם של לבקנים Xenopus הראשן. כמו כן, אנו לדון בשיטות כדי לייעל תשואה, ולהראות דוגמאות הדמיה שני הפוטונים לחיות הקרינה של נוירונים שכותרתו fluorescently ידי SCE.

Protocol

ציוד הגדרת:

1. הציוד החשמלי הנדרש בטכניקה זו הם ממריץ, אוסצילוסקופ, ומחזיק micropipette מצויד חוט כסף כדי להיות מוכנס לתוך micropipette. אנו משתמשים בדרך כלל מכשירים אקסון Axoporator 800A ממריץ, אולם לגירוי נפוצים אחרים, כגון מכשירים גראס SD9 לגירוי מתאימים גם electroporation תא בודד. ממריץ מחוברת headstage, אשר ממשקים עם אלקטרודה הכסף תיל כדי להיות ממוקם בתוך micropipette הזכוכית המכיל פתרון ניהול פנימי. להוביל אחרים ממריץ מחובר לכניסת אוסצילוסקופ, אשר גם מקבלת קלט מן הקרקע חיצוני הראשן. הקרקע חיצוני הראשן הוא פשוט חוט כסף שנשאר בקשר עם electrotonic הראשן במהלך electroporation. המעגל הושלם לאחר micropipette מושם על קשר עם הראשן.
   
   
2. Electroporation תא יחיד דורשת מיקרוסקופ עם מרחק עבודה טובים (לפחות 5 ס"מ), שכן זה נותן מרחב תמרון ומאפשר micropipette להיות הביאו בזווית של כ 30-45 מעלות.

המצאה של micropipettes:

הכנת micropipettes המתאים הוא שלב קריטי פרוטוקול זה. הקושי טמון באיזון טיפ צר (פחות מ 1μm קוטר) עם אחד זה לא יהיה בקלות לשבור כאשר מנקב את הרקמה. מצאנו גם כי עצות עם זווית להתחדד של יותר מ 10 מעלות עדיפים.

1. הכן micropipette זכוכית משך בקוטר טיפ של פחות מ 1μm, וכן להתחדד קצה זווית של יותר מ 10 מעלות.
   1. זכוכית בורוסיליקט עם נימה פנימית עם קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ בקוטר הפנימי של 0.75mm הוא גם מתאים למטרה זו.
      1. זכוכית עבה יחסית מספקת מידה מסוימת של נוקשות אל קצה.
      2. חוט פנימי חשוב בציור בחזרה מלא נוזל לכיוון קצה micropipette.
2. המצאה של טיפים מתאים לעיתים קרובות דורשים מספר שינויים המבוססים על התוצאות שנצפו. רקמות שונות, עשויה לדרוש טיפ עם צורה שונה במקצת או קוטר קצה.

תא בודד electroporation פרוטוקול:

עבור משתמשים חדשים, רצוי להתחיל עם צבעי ניאון dextran מאז, בניגוד חלבוני ניאון מקודדים גנטית, הם יכולים לראות מיד תחת epifluorescence. שימוש של צבעי ניאון מאפשר למשתמש לראות ישירות את המיקום של קצה micropipette בתוך הרקמה, ועל electroporation נותן משוב מיידי, האם הציוד הוגדר כראוי והאם קצה micropipette מתאים.

1. מלאו micropipette עם פתרון של המתחם להיות electroporated או על ידי שימוש במזרק או על ידי טעינת גב מילוי.
   1. אם באמצעות ה-DNA פלסמיד, להבטיח כי הדגימות רעלן פנימי, ללא תשלום, בריכוז בין 1-2μg/ml, שהוכן במים.
   2. ריכוז של צבעי ניאון dextran צריך להיקבע באופן אמפירי. אנו מרבים להשתמש צבעי ניאון מדולל במים כדי 300μM כ.
   3. בדרך כלל, כרכים של 0.5-1μl מספיקים.
   4. לפני העמסה, בקצרה צנטריפוגות פתרונות במהירות גבוהה כדי להפחית את כמות הפסולת חלקיקי להיגרר micropipette, אשר עלול להוביל לסתימה.
   5. בועות האוויר בתוך קצה לעתים קרובות להשפיע על זרימת הנוכחי צריך להיות על ידי וחילצה במרץ מצליף micropipette לפני גובר על headstage.
2. הכנס micropipette לתוך מחזיק או רכוב על headstage micromanipulator 3-ציר. ודא אלקטרודה חוט כסף מוכנס לתוך micropipette, ונמצא בקשר עם פתרון electrotonic הפנימי.
3. הרדימי הראשנים על ידי טבילה% 0.02-MS-222 (3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר) שהוכן מדיום גידול הראשן (הפתרון של שטיינברג, pH 7.4).
   1. בדרך כלל אנחנו משתמשים 44-48 שלב לבקן Xenopus laevis הראשנים בניסויים שלנו.
   2. ראשנים הם בדרך כלל בהרדמה מלאה לאחר כ 5 דקות.
   3. הראשנים כמה יכול להיות בו זמנית בהרדמה כדי להפחית לחכות זמן, לעומת זאת, להימנע מחשיפה MS-222 לתקופות מעבר לשעה 1.
4. העברת הראשן בהרדמה אחת לתא electroporation באמצעות micropipette העברת פלסטיק.
   1. החדר electroporation יכול להתבצע בקלות על ידי גילוף חלל הראשן בצורת Sylgard קטן ® לחסום סיליקון, והוספת חוט הקרקע כסף לתוך חלל כזה שיהיה בקשר עם electrotonic הראשן בחדר בתוך הבית.
5. הראשן עמדה בצד הגבי למעלה בעזרת מכחול לח.
6. מנמיכים את micropipette עד שהוא במגע עם העור, בסמוך ישירות לאזור של עניין.
   1. מיקוד באזורים עם גופי התא בצפיפות יגדיל משמעותית את הסיכויים של electroporation מוצלח.אנחנו בדרך כלל יעד tectum אופטיים הראשן.
   2. תביאו את micropipette ב בזווית של 30 עד 45 מעלות. מסלולי רדודים לעשות ניקור עור קשה יותר, בעוד זוויות תלולה לעתים קרובות לחסום להציג אחד.
7. להורדת המשך micropipette יהיה בתחילה גומה בעור, ולאחר מכן לעבור לתוך הרקמה הבסיסית.
   1. תאים שטחית עדיפים עבור in vivo הדמיה, והוא יכול להיות ממוקד על ידי הקפדה על קצה micropipette הוא הוריד לאט על מנקדים את העור.
8. אדם צריך כל הזמן לפקח על התנגדות micropipette להציב פעם בתוך הרקמה. אם באמצעות 800A Axoporator (אקסון מכשירים), התנגדויות של כ 10-40MΩ הם אופטימליים. ההתנגדות הוא אינדיקטור טוב של אם קוטר קצה מתאים electroporation תא בודד.
   1. התנגדויות micropipette גבוהה (> 100MΩ) מעידים על טיפים או micropipettes סתומים עם טיפים כי הם צרים מדי.
   2. התנגדויות micropipette נמוכה (<10MΩ) מעידים על קוטר טיפ כי הוא גדול מדי, לעיתים קרובות תוצאה של קצה שבור.
   3. אם אתה משתמש ממריץ כי אינו מספק אמצעי התנגדות ישירה, התנגדות micropipette ניתן למדוד באופן עקיף על ידי התבוננות משרעת של פולסי מתח נמדד על ידי האוסילוסקופ (ראו להלן).
9. החל הרכבת מתח.
   1. עבור ה-DNA פלסמיד, הדופק רכבות נמצא יעיל ביותר מורכב שלילי פולסים גל מרובע 1ms משך, שנשא 300Hz עם משך הרכבת הדופק של 500ms.
      1. מתח הדופק נקבע כזה אמפירית כי משרעת של פולסים נמדד על אוסצילוסקופ הוא בין 0.75 לבין 1.5μA.
   2. עבור צבעי ניאון dextran, חיובי פולסים גל מרובע של משך 300μs מועברות בתדר של 300Hz עם משך הרכבת דופק של 10.
      1. כמו פרוטוקול עבור ה-DNA, מתח את הדופק נקבע כזה אמפירית כי משרעת של פולסים נמדד על אוסצילוסקופ הוא בין 0.75 לבין 1.5μA.
      2. התאמות נוספות הפרמטרים הגירוי יכול להתבצע על בסיס התבוננות בתוצאות electroporation תחת epifluorescence.
         1. אם התאים electroporated להופיע עמום, פרמטרים הדופק צריך להיות בהדרגה עד תאים להיראות בהיר יותר.
         2. מצד שני, אם צבירי תאים מסומנים, פרמטרים הדופק צריך להיות מופחת עד תאים בודדים מסומנים.
10. לסגת micropipette, מחדש להכניס לאתר אחר בתוך הרקמה, ולהחיל הרכבת מתח.
    1. כדי לשפר את התשואות, אנחנו בדרך כלל electroporate אתרים מרובים בחצי הכדור כל אחד tectum הראייה הראשן עם מרווח מספיק כדי להבטיח כי תאי שכותרתו אינם חופפים.
11. מעבירים את ראשן electroporated לתוך מיכל עם פתרון גידול של שטיינברג.
    1. הראשנים יהיה במהירות להתאושש מן ההרדמה תוך דקות ספורות.
12. Micropipette אותו יכול לשמש ראשנים רבים. חשוב תמיד לשמור על משרעת של פולסים נצפתה על האוסילוסקופ.
    1. אם משרעת הדופק נותר נמוך באופן משמעותי לאחר הגדלת עוצמת הדופק זה עשוי תוצאה של קצה להיות סתומים, נתפסת לעתים קרובות כאשר electroporating ראשנים רבים בבת אחת.
       1. שיטה לעקור לסתום קצה קטין היא להחיל דופק חיובי אחד אחרי החדרת micropipette לתוך הרקמה.
       2. אם לא ניתן להדביק וחילצה, או סתימת לעתים קרובות חוזר, להחליף את micropipette.
    2. אם משרעת הפולס נשאר גדול מאוד לאחר שהפחית בצורה ניכרת את הפרמטרים הדופק, זה סימן כי יש קצה שבור צריך להיות מוחלף.

הקרנת עבור תאים electroporated בהצלחה:

1. לאחר electroporation, ראשנים מוקרנים עבור תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence זקוף.
2. במקרה של צבעי ניאון, ראשנים עשוי להיות מוקרן לאחר קטנה כמו 30 דקות לאחר electroporation.
   1. מצאנו, לעומת זאת, כי המרווחים כבר קשורים עם רמות הקרינה נמוכות רקע.
3. עבור חלבוני ניאון מקודדים גנטית, ההקרנה מתבצעת בדרך כלל לפחות 12 שעות שלאחר electroporation.
   1. תאים להביע את חלבוני ניאון ימשיכו לקבל בהיר עם הזמן, ולכן התאים עמום עשוי להיות מוקרן מחדש לאחר הפסקה נוספת של 12-24 שעות.
4. הראשנים מורדמים כמתואר לעיל, להציב ® Sylgard קאמרית coverslipped. הראשנים הפרט נבחנים מכן, תחת epifluorescence.
   1. שים לב כי חשיפה מוגזמת לאור epifluorescence תגרום phototoxicity שעלולים להרוג את התא מסומן. לפיכך, לצמצם את כמות הזמן תאים נחשפים לאור ניאון.
5. חזור הראשנים למיכל עם פתרון גידול של שטיינברג.

Discussion

תא בודד electroporation (SCE) הוא כלי רב עוצמה לקביעת תפקוד הגן וביצוע מניפולציה גנטית ממוקדות. השקיפות של הראשן לבקן ואת הנגישות של המוח להפוך את מערכת מודל אידיאלי עבור הדמיה צמיחה עצבי ואירועים תאיים בתוך אורגניזם חי. SCE מאפשרת ויזואליזציה של צמיחה של נוירון בודד, ולבצע מניפולציות תאים אוטונומיים בתוך המוח ללא שינוי אחרת. בעוד מאמר זה וידאו מדגים את הליך electroporation יחיד תא Xenopus laevis ראשנים, בטכניקה זו נעשה שימוש אורגניזמים אחרים, ויש לו גם שימשו פרוסות בהיפוקמפוס בתרביות תאים ניתק.