Biology

완전한 개발 두뇌 속에 생체내에서 단일 세포 Electroporation

Published: July 11, 2008 doi: 10.3791/705

D. Sesath Hewapathirane^1,2, Kurt Haas^1,2

¹Brain Research Centre, University of British Columbia - UBC, ²Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia - UBC

Summary

단일 셀 electroporation (SCE)는 생체내 준비를 포함한 그대로 조직 내의 개별 세포로 DNA 또는 기타 macromolecules의 전달을 허용하는 전문 기술입니다. Xenopus laevis 올챙이의 손상 뇌 내의 뉴런에 형광 염료 또는 플라스미드 DNA의 SCE에 대해 우리가 세부 절차를.

Abstract

단일 셀 electroporation (SCE)는 생체내 준비를 포함한 그대로 조직 내의 개별 세포로 DNA 또는 기타 macromolecules의 전달을 허용하는 전문 기술입니다. 이 기법의 독특한 장점은 주변 조직이 변형 떠나는 동안 실험 조작은이를 통해 글로벌 트리 트먼트로 인한 사람의 휴대 자율 효과를 구별, 각각의 세포에서 수행할 수 있습니다됩니다. 생체내 이미징 기술의 고급과 결합하면 형광 마커 SCE는 세포 형태, 세포 성장, 그리고 초에서 일까지 timescales 이상의 세포 사건의 직접적인 시각화 수 있습니다. 이 기법은 생체내 및 전직 생체내 준비의 다양한 사용되지만, 우리는 Xenopus laevis의 tadpoles에 사용하기 위해이 기술을 최적화합니다. 이 동영상이 문서에서 우리는 세부 흰둥이 Xenopus 올챙이의 손상 뇌 내의 뉴런에 형광 염료 또는 플라스미드 DNA의 SCE에 대한 절차를. 우리는 또한 수율을 최적화하기위한 방법을 논의하고, 찬란 SCE에 의해 분류 뉴런의 사는 두 개의 광자 형광 이미징의 예를 보여줍니다.

Protocol

장비 설정 :

이 기법에 필요한 전기 장비 자극기, 오실로 스코프 및 micropipette에 삽입하는 은색 철사가 장착되어 micropipette 홀더입니다. 우리는 일반적으로 액슨 악기 Axoporator 800A 자극기를 사용하지만 같은 그라스 악기와 같은 다른 일반적인 stimulators는 SD9 stimulators는 단일 셀 electroporation에도 적합합니다. 자극기는 내부 지휘 솔루션을 포함하고있는 유리 micropipette 안에 배치하는 실버 와이어 전극과 인터페이스 headstage에 연결되어 있습니다. 자극기에서 다른 연결은 또한 올챙이 외부 접지로부터 입력을받는 오실로 스코프 입력에 연결되어 있습니다. 올챙이 외부 접지는 단순히 electroporation 동안 올챙이와 electrotonic 접촉에 남아 은색 와이어입니다. micropipette이 올챙이와 접촉에 배치되면 회로가 완료됩니다.
이 책략 공간을 제공하고 micropipette 대해서 30-45 도의 각도에서 가져온 수 있습니다 때문에 단세포 electroporation은 잘 작동 거리 (최소 5cm)와 현미경이 필요합니다.

micropipettes의 제조 :

적절한 micropipettes의 작성이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 어려움은 조직을 펑쳐링 때 쉽게 부숴지지 하나 좁은 팁 (직경 1μm 이하)를 균형에있다. 우리는 또한 큰 10도 정도의 테이퍼 각도와 도움말을 바람직하다는 사실을 발견했습니다.

1μm 이하의 팁 직경, 그리고 이상 10도의 팁 테이퍼 각도로 뽑아 유리 micropipette를 준비합니다.
1. 0.75mm의 1.5mm와 내경의 외경과 내부 필라멘트와 Borosilicate 유리가 잘 이러한 목적에 가장 적합합니다.
  1. 비교적 두꺼운 유리 팁에 강성의 학위를 제공합니다.
  2. 내부 필라멘트는 micropipette 팁쪽으로 채워진 액체를 그리기에 중요합니다.
적절한 도움말 제작은 종종 관찰 결과에 따라 몇 가지 수정을 요구할 것입니다. 다른 조직은 약간 다른 모양 팁 직경과 팁을 요구할 수 있습니다.

단일 셀 electroporation 프로토콜 :

신규 사용자를 위해, 그것은 유전자 코드 형광 단백질과는 달리, 그들은 즉시 epifluorescence 아래에서 볼 수있다, 때문에 형광 dextran의 염료와 함께 시작하는 것이 좋습니다. 형광 염료의 사용은 사용자가 직접 조직 내에서 micropipette 팁의 위치를 볼 수있게하고,시 electroporation은 장비가 제대로 micropipette 팁 적절한 여부를 설정하고되었는지 여부에 대해서 즉각적인 피드백을 제공합니다.

중 로딩 주사기를 사용하거나 백업 작성하여 electroporated하는 화합물의 솔루션 micropipette를 입력합니다.
1. 플라스미드 DNA를 사용하는 경우, 물 속에 준비, 샘플은 내독소 - 무료 확인하고, 1-2μg/ml 사이의 농도에서.
2. 형광 dextran의 염료의 농도는 경험적으로 결정하여야한다. 우리는 종종 약 300μM로 물에 희석 형광 염료를 사용합니다.
3. 일반적으로, 0.5 - 1μl의 볼륨이 충분합니다.
4. 이전 로딩하기 위해 간략하게 괴롭히는가 발생할 수 있습니다 micropipette로 그려진 미립자 파편의 양을 줄이기 위해 고속 솔루션을 원심 분리기.
5. 팁 내에 공기 방울은 종종 현재의 흐름에 영향을하고 적극적으로 headstage에 장착하기 전에 micropipette를 flicking하여 dislodged해야합니다.
홀더에 micropipette를 삽입하거나 headstage 3 축 micromanipulator에 장착. 그 은색 와이어 전극이 micropipette에 삽입하고, 내부 솔루션 electrotonic 연락입니다 확인하십시오.
올챙이 양육 매체 (스타 인 버그의 솔루션, 산도 7.4)에 준비가 0.02 % MS - 222 (3 - 아미노 벤 초산 에틸 에스테르)의 침수에 의해 tadpoles를 마취.
1. 우리는 일반적으로 실험에서 무대 44-48 흰둥이 Xenopus laevis tadpoles를 사용합니다.
2. Tadpoles는 약 5 분 후에 일반적으로 완전히 anesthetized 있습니다.
3. 여러 tadpoles 기다리는 시간을 줄이기 위해 동시에 anesthetized 수 있습니다, 그러나 1 시간 이상의 기간 동안 MS - 222에 노출하지 마십시오.
플라스틱 전송 micropipette를 사용하여 electroporation 챔버에 하나 anesthetized 올챙이을 전송합니다.
1. electroporation 챔버 쉽게 작은 Sylgard ® 실리콘 블록의 올챙이 모양의 구멍을 조각하고, 그것은 챔버에있는 올챙이와 electrotonic 연락을 것입니다 이러한 캐비티에 은색 접지 와이어를 삽입하여 내부에서 만들 수 있습니다.
를 사용하여 위치 올챙이 등의 측면 페인트를 moistened.
그것은 피부와 접촉에 대한 관심의 영역에 직접 인접한 때까지 micropipette를 낮춥니다.
1. 밀도가 높은 포장 세포 기관과 지역을 타겟팅하면 크게 성공 electroporation의 기회를 증가할 것이다.우리는 일반적으로 올챙이 광학 tectum를 타겟팅할 수 있습니다.
2. 30-45 도의 각도에서 micropipette 가져와. 험한 각도가 자주 하나 전망을 방해하면서 얕은 궤도는 피부 찔린 더 어렵게합니다.
지속적인 micropipette의 저하 처음 피부 보조개 다음 기본 조직으로 통과됩니다.
1. 피상적인 세포는 생체내 이미징에 대한 선호하고 있으며, micropipette 팁은 피부의 dimpling에 따라 천천히 저하되어함으로써 타겟팅할 수 있습니다.
하나는 지속되면 조직 내에 위치 micropipette 저항을 모니터링해야합니다. Axoporator 800A (액슨 인 스트 루먼트), 약 10 40MΩ의 resistances를 사용하는 경우 최적입니다. 저항의 팁 직경은 단일 셀 electroporation에 적합한지 여부의 좋은 지표입니다.
1. 하이 micropipette의 resistances은 (> 100MΩ) 너무 좁고 조언들로 가득 찼어 팁 또는 micropipettes 나타내는 있습니다.
2. 낮은 micropipette의 resistances (<10MΩ)는 종종 깨진 팁의 결과가 너무 커서 팁 직경을 나타내는 있습니다.
3. 직접 저항 측정을 제공하지 않습니다 자극기를 사용하는 경우, micropipette 저항은 간접적으로 오실로 스코프 (아래 설명)에 의해 측정 전압 펄스의 진폭을 관찰하여 측정하실 수 있습니다.
전압 열차를 적용합니다.
1. 플라스미드 DNA를, 펄스는 500ms의 펄스 트레인 기간과 300Hz에서 제공 기간이 1ms 부정 사각형 웨이브 펄스의 이루어져 가장 효과적으로 발견 열차.
  1. 펄스 전압은 오실로 스코프에서 측정된 펄스의 진폭이 0.75과 1.5μA 사이는 것을 경험적으로 그러한 결정됩니다.
2. 형광 염료 dextran의 경우, 300μs 기간의 긍정적인 사각형 웨이브 펄스는 10ms의 펄스 트레인 기간과 300Hz의 주파수에서 전달됩니다.
  1. DNA에 대한 프로토콜과 마찬가지로 펄스 전압은 오실로 스코프에서 측정된 펄스의 진폭이 0.75과 1.5μA 사이는 것을 경험적으로 그러한 결정됩니다.
  2. 자극 매개 변수 추가 조정은 epifluorescence 아래 electroporation의 결과를 관찰을 바탕으로 만들 수 있습니다.
    1. electroporated 세포가 희미 나타나면 세포가 밝은 나타날 때까지, 펄스 매개 변수는 점차 증가한다.
    2. 세포의 클러스터는 레이블이있는 경우 하나의 세포가 표시되기 전까지는 반면에, 펄스 매개 변수는 감소한다.
micropipette을 접어야 조직 내의 다른 사이트에 다시 삽입하고, 전압 기차를 적용할 수 있습니다.
1. 수율을 개선하기 위해, 우리는 일반적으로 해당 레이블이 붙은 세포가 중복되지 않도록 충분한 간격 올챙이 광학 tectum 각 반구에서 여러 사이트를 electroporate.
스타 인 버그의 양육 솔루션 컨테이너에 electroporated 올챙이을 전송합니다.
1. Tadpoles는 빠른 속도로 몇 분 이내에 마취에서 회복됩니다.
동일한 micropipette는 수많은 tadpoles 사용할 수 있습니다. 끊임없이 오실로 스코프에서 발견된 펄스의 진폭을 관찰하는 것이 중요합니다.
1. 펄스 진폭이 크게 펄스 강도를 증가 후 낮은 남아있다면 이런 현상이 가능성이 한 번에 많은 tadpoles를 electroporating 때 종종 볼 수 막힌되는 팁의 결과입니다.
  1. 사소한 팁 방해할을 이동시키다하는 방법은 조직에 micropipette 삽입 후 하나의 긍정적인 펄스를 적용하는 것입니다.
  2. 덩어리가 dislodged, 또는 자주 반복을 막히는 수없는 경우, micropipette를 교체하십시오.
2. 펄스 진폭이 크게 펄스 매개 변수를 감소 이후 매우 큰 남아있을 경우, 이것은 끝 고장 및 교체해야하는 기호입니다.

성공적으로 electroporated 세포에 대한 검사 :

electroporation 후, tadpoles는 똑바로 epifluorescence 현미경을 사용하여 레이블이 세포에 대한 검사를하고 있습니다.
형광 염료의 경우, tadpoles는 빠르면 30 분 이후 electroporation 후 심사 수 있습니다.
1. 우리는 더 이상 간격이 낮은 배경 형광 수준과 연관된 것을, 그러나 발견했다.
유전자 인코딩 형광 단백질의 경우, 심사는 일반적으로 최소 12 시간 이후의 electroporation을 실시합니다.
1. 형광 단백질을 표현하는 세포는 시간을 더 밝게하려면 것입니다 따라서 희미한 전지 12~24시간의 추가 간격 후 다시 심사 수 있습니다.
Sylgard ® 챔버에 배치, 위에서 설명한 및 coverslipped로 Tadpoles는 anesthetized 있습니다. 개인 tadpoles는 다음 epifluorescence에 따라 심사됩니다.
1. epifluorescence 빛에 과도하게 노출이 표시된 세포를 죽일 수 있습니다 phototoxicity 발생됩니다. 따라서 세포가 형광 불빛에 노출되는 시간을 최소화합니다.
스타 인 버그의 양육 솔루션 컨테이너에 tadpoles를 반환합니다.

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Discussion

단일 셀 electroporation (SCE)는 유전자 기능을 결정하고 타겟 유전자 조작을 수행하기위한 강력한 도구입니다. 흰둥이 올챙이의 투명성과 두뇌의 접근이 이상적으로 살아있는 유기체 내에서 성장과 세포의 연결 이벤트를 시각화에 적합한이 모델 시스템을합니다. SCE는 단일 신경 세포의 성장의 시각화를 허용하고, 그렇지 않으면 변형 두뇌 속에 휴대 자율 조작을 수행할 수 있습니다. 이 동영상이 문서 Xenopus laevis tadpoles에서 단일 셀 electroporation에 대한 절차를 보여주는 동안,이 기법은 다른 생물에서 사용되었으며, hippocampal 조각과 dissociated 셀 문화도 사용되고 있습니다.

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Acknowledgments

저자는 SCE micromicropipette 팁의 전자 현미경 이미지에 대한 미숙 신경 세포와 데릭 던필드의 시간 경과 영화 캡처 성장을위한 Sharmin Hossain 감사합니다.

References

Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).
Dunfield, D., Haas, K. Single cell electroporation. Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.
Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).