無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

Summary

単一細胞電気穿孔（SCE）は、in vivoでの製剤を含む無傷の組織内の個々の細胞へのDNAや他の高分子の配信を可能にする特殊な技術です。アフリカツメガエルオタマジャクシの無傷の脳内の神経細胞への蛍光色素またはプラスミドDNAのSCEのためここでは、詳細手順を。

Abstract

単一細胞電気穿孔（SCE）は、in vivoでの製剤を含む無傷の組織内の個々の細胞へのDNAや他の高分子の配信を可能にする特殊な技術です。この手法の明確な利点は、グローバルな治療から生じるものから、周囲の組織変更されず、それによって特徴的な細胞自律的な効果を残したまま、実験操作が個々のセルで実行される可能性があるということです。 in vivoイメージング技術の高度と組み合わせると、蛍光マーカーのSCEは、細胞形態、細胞増殖、および秒から数日に及ぶ時間スケール上の細胞内イベントの直接可視化を可能にします。この手法は、生体内と生体外での準備での様々な使用されているが、我々はアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用するためにこの手法を最適化してきました。このビデオの記事で、我々は詳細アルビノアフリカツメガエルオタマジャクシの無傷の脳内の神経細胞への蛍光色素またはプラスミドDNAのSCEのための手順を。我々はまた、歩留まりを最適化する方法を議論し、蛍光SCEによって標識されたニューロンのライブ二光子蛍光イメージングの例を示します。

Protocol

機器のセットアップ：

1. この技法のために必要な電気機器は、刺激、オシロスコープ、およびマイクロピペットに挿入される銀のワイヤーを装着したマイクロピペットホルダーです。我々は一般的に軸索の楽器Axoporator 800A刺激を使用して、しかし、そのようなグラスの楽器のような他の一般的な刺激は、SD9刺激は、単一セルのエレクトロポレーションにも適しています。刺激は、内部の導電性溶液の入ったガラスのマイクロピペットの内部に配置される銀線電極とのインタフェースヘッドステージに接続されている。刺激装置から他のリードにもオタマジャクシ外部地面からの入力を受け取るオシロスコープの入力に接続されています。オタマジャクシ外部接地は、単純にエレクトロポレーション中にオタマジャクシと電気緊張接触したままで銀線です。マイクロピペットは、オタマジャクシと接触して置かれると回路が完了です。
   
   
2. これが操作する余地を与え、マイクロピペットを約30-45度の角度で持ち込むことを可能にするため、単一細胞のエレクトロポレーションは、良いワーキングディスタンス（少なくとも5センチメートル）と顕微鏡が必要です。

マイクロピペットの作製：

適切なマイクロピペットの準備は、このプロトコルの重要なステップです。難しさは、組織を穿刺するときに容易に中断されませんいずれかの狭い先端（直径1μm以下）のバランスにあります。我々はまた、10度よりのテーパー角と先端が好ましいことを見出した。

1. 1μm以下の先端径を持つ引っ張らガラスのマイクロピペット、および10度よりも大きいの先端のテーパ角度を準備します。
   1. 0.75ミリメートルの1.5ミリメートル、内径、外径と内部フィラメントとホウケイ酸ガラスは、この目的に適しています。
      1. 比較的厚いガラスは、先端部に剛性の程度を提供します。
      2. 内部フィラメントは、マイクロピペットの先端に向かってバックで満たされた流体を描く上で重要です。
2. 適切なヒントの作製は、しばしば観察された結果に基づいていくつかの変更が必要になります。異なる組織がわずかに異なる形状や先端径を持つ先端が必要な場合があります。

単一細胞のエレクトロポレーションプロトコル：

新しいユーザーの場合、それは遺伝的に符号化された蛍光タンパク質とは異なり、彼らはすぐに落射蛍光で見ることができる、ので、蛍光デキストランの色素で開始することをお勧めします。蛍光色素の使用は、直接組織内にマイクロピペットの先端の位置を確認するために、ユーザーを可能にし、エレクトロポレーションした時点で機器が正しく設定されているかどうかに関して即座にフィードバックを与え、マイクロピペットの先端が適切であるかどうか。

1. どちらローディングシリンジを使用するか、バックを充填してエレクトロポレーションされる化合物の溶液をマイクロピペットを埋める。
   1. プラスミドDNAを使用している場合は、水で調製した試料はエンドトキシンフリーであることを確認し、1-2μg/mlの間の濃度で。
   2. 蛍光デキストランの色素の濃度は、経験的に決定されるべきである。私たちはしばしば約満たされたニューロンに水で希釈した蛍光色素を使用してください。
   3. 通常は、0.5〜1μlののボリュームは十分です。
   4. ロードする前に、簡単に目詰まりにつながる可能性のあるマイクロピペットに引き込まれる粒子状破片の量を、減らすために高速でソリューションを遠心する。
   5. 先端内の気泡は、多くの場合、現在の流れに影響を及ぼし、精力的にステージに取り付ける前にマイクロピペットをフリックすることで外れている可能があります。
2. ホルダーにマイクロピペットを挿入するか、ステージ3軸マニピュレータに取り付け。銀線電極をマイクロピペットに挿入されているか確認し、内部ソリューションとの電気緊張接触している。
3. オタマジャクシ飼育培地（Steinbergの溶液、pH 7.4）で作成したMS - 222（3 - アミノ安息香酸エチルエステル）0.02％に浸漬してオタマジャクシを麻酔。
   1. 我々は通常、我々の実験ではステージ44から48アルビノアフリカツメガエルのオタマジャクシを使用してください。
   2. オタマジャクシは約5分後に通常完全に麻酔する。
   3. いくつかのオタマジャクシは、待機時間を削減すると同時に麻酔かもしれない、しかし、1時間を越える期間のMS - 222への暴露を避ける。
4. プラスチック製のトランスファーピペットを用いてエレクトロポレーションチャンバーに単一の麻酔オタマジャクシを転送します。
   1. エレクトロポレーションチャンバーは、容易に®小さなSylgardでおたまじゃくしの形をした空洞を彫刻シリコンブロック、そしてそれはチャンバー内のオタマジャクシで電気緊張接触になるように空洞に銀のアース線を挿入することにより、社内で行うことができます。
5. 湿らせた絵筆を使って位置オタマジャクシ背側を。
6. それは、皮膚との接触に関心のある領域に直接隣接するまで、マイクロピペットを下ろします。
   1. 密集した細胞体との領域を標的にすることは大いに成功したエレクトロポレーションの可能性が増加します。我々は通常、オタマジャクシ視蓋をターゲットにしています。
   2. 30から45度の角度でのマイクロピペットをもたらす。急な角度はしばしば一つの視界を妨げないしながら浅く軌跡は、皮膚の穿刺をより困難なものにする。
7. 続けマイクロピペットの低下は、最初に皮膚をディンプルし、基になる組織に通過します。
   1. 表層細胞は、in vivoイメージングのために好ましく、マイクロピペットの先端が皮膚のえくぼ形成によって徐々に低下していることを確認することでターゲットとすることができます。
8. 一つは、常に一度に組織内に配置されたマイクロピペットの抵抗を監視する必要があります。 Axoporator 800A（アクソンインスツルメンツ）を使用している場合は、約10 -40mΩのの抵抗が最適です。抵抗は、先端の直径は、単一細胞電気穿孔法に適しているかどうかの良い指標です。
   1. 高マイクロピペットの抵抗（>100MΩ）が狭すぎるのヒントが詰まってヒントまたはマイクロピペットを示すものである。
   2. 低マイクロピペットの抵抗（<10MΩ）は多くの場合、壊れた先端の結果が大きすぎる先端径の指標となる。
   3. 直接抵抗測定を提供していない刺激を使用している場合は、マイクロピペットの抵抗を間接的にオシロスコープ（後述）によって測定される電圧パルスの振幅を観察することによって測定することができる。
9. 電圧列車を適用します。
   1. プラスミドDNAの場合、パルスは、訓練期間が1msの負の方形波パルスで構成される最も有効であることが判明し、500ミリ秒のパルス列の持続時間で300Hzので配信。
      1. パルス電圧をオシロスコープで測定したパルスの振幅が0.75と1.5μAの間にあることが経験的にそのように決定されます。
   2. 蛍光デキストランの染料の場合は、300μsの期間の正の方形波パルスは10msのパルストレインの期間で300Hzの周波数で供給されています。
      1. DNAのためのプロトコルと同様に、パルス電圧をオシロスコープで測定したパルスの振幅が0.75と1.5μAの間にあることが経験的にそのように決定されます。
      2. 刺激のパラメータに追加の調整は、落射蛍光下でエレクトロポレーションの結果を観察に基づいて行うことができる。
         1. エレクトロポレーションした細胞が暗く表示される場合、細胞が明るく表示されるまで、パルスパラメータは徐々に大きくする必要があります。
         2. 細胞のクラスターラベルが付けられている場合、単一の細胞が標識されるまで、その一方で、、パルスパラメータを減らす必要があります。
10. マイクロピペットを撤回、組織内の別のサイトに再挿入、および電圧列車を適用する。
    1. 歩留まりを向上させるために、我々は一般的に標識された細胞が重複しないことを保証するために十分な間隔でオタマジャクシ視蓋の各半球で複数のサイトをエレクトロ。
11. Steinbergの飼育剤の容器中にエレクトロオタマジャクシを転送する。
    1. オタマジャクシは、急速に数分以内に麻酔から回復します。
12. 同じマイクロピペットは、多数のオタマジャクシに使用することができます。常にオシロスコープで測定したパルスの振幅を観測することが重要です。
    1. 大幅にパルス強度を増加した後、パルス振幅が低いままなら、これは可能性が一気に多くのオタマジャクシをelectroporatingする際によく見られる目詰まりしている先端の結果です。
       1. マイナーチップ詰まりを取り除くために、方法は、組織にマイクロピペットを挿入した後、単一の正のパルスを適用することです。
       2. 詰まりが外れ、または頻繁に再発を詰まらせることができない場合は、マイクロピペットを交換してください。
    2. パルスの振幅が大幅にパルスパラメータを減少した後非常に大きいままの場合、これはチップが壊れ、交換が必要になっているサインです。

成功したエレクトロポレーションした細胞のスクリーニング：

1. エレクトロポレーション後、オタマジャクシは直立落射蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞についてスクリーニングされる。
2. 蛍光色素の場合には、オタマジャクシは30分ほど後にエレクトロポレーション後にスクリーニングすることができる。
   1. 我々は、より長い間隔が低く、バックグラウンド蛍光レベルに関連付けられていること、しかし、発見した。
3. 遺伝的に符号化された蛍光タンパク質については、スクリーニングは通常、少なくとも12時間後にエレクトロポレーションを実施しています。
   1. 蛍光タンパク質を発現する細胞が時間とともに明るく取得していく、そのため、薄暗い細胞は12-24時間のさらに他のインターバル後に再スクリーニングすることができる。
4. 上記のようなオタマジャクシはSylgard ®チャンバー内に設置し、封入、麻酔する。個々のオタマジャクシは、落射蛍光で観察されています。
   1. 落射蛍光光への過度の曝露は標識細胞を殺すことができる光毒性になることに注意して下さい。したがって、細胞を蛍光灯にさらされている時間の量を最小限に抑える。
5. Steinbergの飼育のソリューションを使ってコンテナにオタマジャクシを返します。

Discussion

単一細胞電気穿孔（SCE）は、遺伝子機能を決定し、標的遺伝子操作を実行するための強力なツールです。アルビノおたまじゃくしの透明性と脳のアクセシビリティは、理想的に生きて生体内で神経細胞の成長と細胞内イベントの可視化のための最適なこのモデルシステムを作る。 SCEは、単一のニューロンの成長の可視化を可能にし、そうでなければ変更されずに脳内で細胞自律的な操作を実行する。このビデオの記事は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの単一細胞電気穿孔するための手順を示していますが、この手法は他の生物で使用されており、また、海馬スライスと解離細胞の培養物中で使用されています。