Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Summary

De uma única célula eletroporação (SCE) é uma técnica especializada permitindo a entrega de DNA ou outras macromoléculas em células individuais dentro do tecido intacto, inclusive em preparações in vivo. Aqui detalhamos o procedimento para a SCE de um corante fluorescente ou DNA plasmídeo em neurônios dentro do cérebro intacto do Xenopus laevis girino.

Abstract

De uma única célula eletroporação (SCE) é uma técnica especializada que permite a entrega de DNA ou outras macromoléculas em células individuais dentro do tecido intacto, inclusive em preparações in vivo. A vantagem desta técnica é que manipulações experimentais podem ser realizadas em células individuais, deixando o tecido circundante inalterada, assim, distinguir células autônomas efeitos daqueles decorrentes de tratamentos global. Quando combinado com o avançado em técnicas de imagem in vivo, a SCE de marcadores fluorescentes permite a visualização direta da morfologia celular, crescimento celular, e eventos intracelulares em escalas de tempo variando de segundos a dias. Embora esta técnica é usada em uma variedade de preparações in vivo e ex vivo, temos esta técnica otimizada para uso em girinos Xenopus laevis. Neste artigo de vídeo, detalhamos o procedimento para a SCE de um corante fluorescente ou DNA plasmídeo em neurônios dentro do cérebro intacto do albino Xenopus girino. Discutimos, também, métodos para otimizar o rendimento, e mostrar exemplos de imagens de dois fótons de fluorescência de neurônios ao vivo fluorescente etiquetado pelo SCE.

Protocol

Equipamentos de set-up:

1. Os equipamentos elétricos necessários para esta técnica são um estimulador, um osciloscópio, e um suporte de micropipeta equipado com um fio de prata ao ser inserido na micropipeta. Normalmente usamos uma Axon instrumentos Axoporator 800A estimulador, no entanto outros estimuladores comuns, tais como os instrumentos estimuladores Grama SD9 também são adequados para uma única célula eletroporação. O estimulador é ligado ao headstage que faz interface com o eletrodo de arame de prata para ser colocado dentro da micropipeta de vidro contendo uma solução interna de condução. Outro fio do estimulador é ligado à entrada do osciloscópio, que também recebe a entrada do chão girino externo. O chão girino externa é um simples fio de prata que permanece em contato com o electrotonic girino durante a eletroporação. O circuito está completo uma vez que a micropipeta é colocado em contato com o girino.
   
   
2. Eletroporação única célula exige um microscópio com uma boa distância de trabalho (pelo menos 5 centímetros), pois isto dá margem de manobra e permite que o micropipeta para ser trazido em um ângulo de cerca de 30-45 graus.

Fabricação de micropipetas:

Preparação de micropipetas adequado é um passo crítico neste protocolo. A dificuldade reside em equilibrar uma ponta estreita (menos de 1 Hm de diâmetro) com um que não vai quebrar facilmente quando a perfuração do tecido. Temos também descobriram que as pontas com um ângulo de inclinação de mais de 10 graus são preferíveis.

1. Prepare uma micropipeta de vidro puxado com um diâmetro da ponta de menos de 1 Hm, e um ângulo de ponta do cone maior que 10 graus.
   1. Vidro de borosilicato com um filamento interna com diâmetro externo de diâmetro 1,5 mm e interno de 0,75 milímetros é bem adequado para este fim.
      1. O vidro relativamente grossa fornece um grau de rigidez à ponta.
      2. O filamento interno é importante na elaboração de volta cheio de líquido para a ponta micropipeta.
2. Fabricação de dicas adequadas, muitas vezes, exigem várias modificações com base nos resultados observados. Diferentes tecidos pode exigir uma ponta com uma forma ligeiramente diferente ou diâmetro da ponta.

De uma única célula protocolo eletroporação:

Para novos usuários, é aconselhável começar com corantes fluorescentes dextran uma vez que, ao contrário geneticamente codificado proteínas fluorescentes, que pode ser imediatamente visto sob epifluorescência. Uso de corantes fluorescentes permite ao usuário ver diretamente a localização da ponta da micropipeta dentro do tecido, e sobre eletroporação dá um feedback instantâneo para saber se o equipamento foi configurado corretamente e se a ponta micropipeta é apropriado.

1. Preencha micropipeta com solução do composto a ser electroporated ou usando uma seringa de carga ou de back-enchimento.
   1. Se estiver usando DNA plasmídeo, garantir que as amostras são-endotoxina livre, e em uma concentração entre 1-2μg/ml, preparada em água.
   2. A concentração de corantes fluorescentes dextran deve ser determinado empiricamente. Muitas vezes usamos corantes fluorescentes diluído em água até cerca de 300μM.
   3. Normalmente, os volumes de 0,5-1μl são suficientes.
   4. Antes do carregamento, brevemente centrífuga soluções em alta velocidade para reduzir a quantidade de detritos de partículas atraídas para a micropipeta, que pode levar ao entupimento.
   5. Bolhas de ar dentro da ponta, muitas vezes afetam o fluxo de corrente e deve ser desalojado por flicking vigorosamente a micropipeta antes da montagem na headstage.
2. Inserir micropipeta para titular ou headstage montado em um micromanipulador de 3 eixos. Assegurar que os eletrodos fio de prata é inserido micropipeta, e está em contato com a solução electrotonic interna.
3. Anestesiar girinos por imersão em 0,02% MS-222 (3-aminobenzóico ácido etil éster) preparada em meio de criação de girinos (solução Steinberg, pH 7,4).
   1. Normalmente usamos estágio 44-48 albino Xenopus laevis girinos em nossos experimentos.
   2. Girinos são geralmente totalmente anestesiado após aproximadamente 5 minutos.
   3. Girinos podem ser anestesiados várias ao mesmo tempo para reduzir tempo de espera, no entanto, evitar a exposição a MS-222, por períodos superiores a 1 hora.
4. Transferência de um girino única anestesiados para a câmara de eletroporação usando uma micropipeta transferência de plástico.
   1. A câmara de eletroporação pode ser feita facilmente em casa por esculpir uma cavidade em forma de girino em uma pequena Sylgard ® bloco de silicone ea inserção de um fio terra de prata na cavidade tal que estarão em contato com o girino electrotonic na câmara.
5. Posição dorsal lado girino até usando um pincel umedecido.
6. Abaixe a micropipeta até que esteja em contacto com a pele, e adjacente à região de interesse.
   1. Segmentação regiões com corpos celulares densamente vai aumentar muito as chances de sucesso eletroporação.Normalmente, o alvo tectum girino óptica.
   2. Trazer a micropipeta em um ângulo de 30 a 45 graus. Trajetórias mais rasas fazer cortes na pele mais difícil, enquanto os ângulos mais íngremes, muitas vezes obstruem nossa visão.
7. Redução contínua da micropipeta inicialmente dimple a pele, e depois passar para o tecido subjacente.
   1. Células superficiais são os preferidos para in vivo de imagens, e pode ser alvo de garantir que a ponta micropipeta é reduzida lentamente sobre ondulações da pele.
8. Deve-se monitorar constantemente a resistência micropipeta uma vez colocado dentro do tecido. Se estiver usando uma 800A Axoporator (Axon Instruments), resistências de aproximadamente 10 40MΩ são ótimas. A resistência é um bom indicador de se o diâmetro da ponta é apropriado para uma única célula eletroporação.
   1. Resistências micropipeta alta (> 100MΩ) são indicativos de dicas entupidos ou micropipetas com dicas que são muito estreitas.
   2. Resistências micropipeta baixo (<10MΩ) são indicativos de um diâmetro da ponta que é muito grande, muitas vezes resultado de uma ponta quebrada.
   3. Se estiver usando um estimulador que não fornece uma medida direta da resistência, a resistência micropipeta pode indirectamente medidos, observando a amplitude dos pulsos de voltagem medida pelo osciloscópio (discutido abaixo).
9. Aplicar trem de tensão.
   1. Para DNA plasmídeo, pulso trens encontrado para ser mais eficazes consistem em pulsos de onda quadrada negativa 1ms de duração, entregue em 300Hz com duração de pulso de trem de 500ms.
      1. A tensão do pulso é determinada empiricamente tal que a amplitude de pulsos medidos no osciloscópio é entre 0,75 e 1.5μA.
   2. Para corantes fluorescentes dextran, positiva pulsos de onda quadrada de duração 300μs são entregues em uma freqüência de 300Hz com duração de pulso de trem de 10ms.
      1. Como com o protocolo de DNA, a tensão do pulso é determinada empiricamente tal que a amplitude de pulsos medidos no osciloscópio é entre 0,75 e 1.5μA.
      2. Ajustes adicionais para os parâmetros de estímulo pode ser feito com base na observação dos resultados de eletroporação sob epifluorescência.
         1. Se as células electroporated aparecem dim, os parâmetros de pulso deve ser gradualmente aumentada até que as células aparecem mais brilhantes.
         2. Por outro lado, se grupos de células são rotulados, os parâmetros de pulso deve ser reduzida até células individuais são rotulados.
10. Retrair micropipeta, re-inserir em um site diferente dentro do tecido, e aplicar trem de tensão.
    1. Para melhorar o rendimento, que normalmente electroporate vários sites em cada hemisfério do tectum girino óptica com espaçamento suficiente para assegurar que células marcadas não se sobrepõem.
11. Transferir o girino electroporated em um recipiente com solução de Steinberg criação.
    1. Girinos se recuperar rapidamente da anestesia em poucos minutos.
12. A micropipeta mesmo pode ser usado para girinos numerosos. É importante observar constantemente a amplitude dos pulsos observados no osciloscópio.
    1. Se a amplitude do pulso permanece baixa após a aumentar significativamente a intensidade de pulso este é provavelmente um resultado da ponta sendo obstruídas, muitas vezes visto quando electroporating muitos girinos em uma sessão.
       1. Um método para desalojar uma obstrução ponta menor é a aplicação de um único pulso positivo depois de inserir o micropipeta para o tecido.
       2. Se a obstrução não pode ser desalojado, ou entupimento recorrência freqüente, substitua a micropipeta.
    2. Se a amplitude do pulso continua a ser muito grande após diminuindo significativamente os parâmetros de pulso, este é um sinal de que a ponta quebrou e precisa ser substituído.

Triagem para as células com sucesso electroporated:

1. Após a eletroporação, os girinos são selecionados para células marcadas usando um microscópio de epifluorescência, na posição vertical.
2. No caso de tinturas fluorescentes, os girinos podem ser rastreados após tão pouco como 30 minutos após a eletroporação.
   1. Encontramos, no entanto, que intervalos mais longos estão associados com níveis mais baixos de fluorescência de fundo.
3. Para geneticamente codificado proteínas fluorescentes, a triagem é geralmente conduzida pelo menos 12 horas após a eletroporação.
   1. Células que expressam proteínas fluorescentes continuará a receber mais brilhantes com o tempo, portanto, células dim pode ser re-examinados após um intervalo adicional de 12-24 horas.
4. Girinos são anestesiados, como descrito acima, colocadas em uma câmara de Sylgard ® e lamínulas. Girinos individuais são, então, examinado sob epifluorescência.
   1. Note-se que a exposição excessiva à luz de epifluorescência, irá resultar em fototoxicidade que pode matar a célula rotulados. Portanto, minimizar a quantidade de tempo que as células são expostas à luz fluorescente.
5. Retorno girinos para recipiente com solução de Steinberg criação.

Discussion

De uma única célula eletroporação (SCE) é uma ferramenta poderosa para determinar a função do gene e realizando manipulação genética alvo. A transparência do girino albino e da acessibilidade do cérebro tornam este sistema modelo ideal para a visualização de crescimento neuronal e eventos intracelulares dentro de um organismo vivo. SCE permite a visualização do crescimento de um único neurônio, e para realizar manipulações de células-autônoma dentro de um cérebro de outra forma inalterada. Embora este artigo vídeo demonstra o processo de uma única célula eletroporação em Xenopus laevis girinos, esta técnica tem sido usada em outros organismos, e também tem sido usado em fatias do hipocampo e culturas de células dissociadas.