Single Cell elektroporation in vivo i den intakta växande hjärnan

Summary

Encelliga elektroporation (SCE) är en specialiserad teknik som möjliggör leverans av DNA eller andra makromolekyler i enskilda celler i intakta vävnader, inklusive in vivo förberedelser. Här har vi detalj förfarandet för SCE av en fluorescerande färg eller plasmid-DNA till nervceller i den intakta hjärnan i Xenopus laevis grodyngel.

Abstract

Encelliga elektroporation (SCE) är en specialiserad teknik för leverans av DNA eller andra makromolekyler i enskilda celler i intakta vävnader, inklusive in vivo förberedelser. Den klara fördelen med denna teknik är att experimentella manipulationer kan utföras på enskilda celler medan den omgivande vävnaden oförändrad, vilket skiljer cell-autonoma effekter från dem som följer av den globala behandlingar. I kombination med avancerad in vivo avbildningstekniker, tillstånd SCE av fluorescerande markörer direkt visualisering av cellulära morfologi, celltillväxt, och intracellulära händelser under tidsskalor alltifrån sekunder till dagar. Även denna teknik används i olika in vivo och ex förberedelser vivo, har vi optimerat denna teknik för användning i Xenopus laevis grodyngel. I denna video artikeln detalj vi förfarandet för SCE av en fluorescerande färg eller plasmid-DNA till nervceller i den intakta hjärnan i albino Xenopus grodyngel. Vi diskuterar också metoder för att optimera avkastning och visar exempel av levande två-photon fluorescens avbildning av nervceller fluorescerande av SCE.

Protocol

Utrustning set-up:

1. Den elektriska utrustning som krävs för denna teknik är en stimulator, ett oscilloskop och en mikropipett hållare försedd med en silvertråd för att föras in i mikropipetten. Vi använder vanligtvis en Axon instrument Axoporator 800A stimulator, men andra vanliga stimulatorer som Grass instrument SD9 stimulatorer lämpar sig också för encelliga elektroporation. Stimulatorn är ansluten till headstage som gränssnitt med silvertråd elektroden placeras innanför glaset mikropipett innehåller en intern ledande lösning. Den andra leder från stimulatorn är ansluten till oscilloskopet input, som också får bidrag från grodyngel externa marken. Den grodyngel externa marken är helt enkelt en silvertråd som finns kvar i electrotonic kontakt med grodyngel under elektroporation. Kretsen är komplett när mikropipett placeras i kontakt med grodyngel.
   
   
2. Enda cell elektroporation kräver ett mikroskop med en god arbetsmiljö avstånd (minst 5 cm), eftersom det ger manöverutrymme och gör att mikropipett föras i en vinkel på ca 30-45 grader.

Tillverkning av mikropipetter:

Beredning av lämpliga mikropipetter är ett kritiskt steg i detta protokoll. Svårigheten ligger i att balansera en smal spets (mindre än 1μm i diameter) med en som inte kommer lätt sönder när punktering vävnaden. Vi har också funnit att tips med en kona vinkel större än 10 grader är att föredra.

1. Förbered en drog glas mikropipett med en spets diameter på mindre än 1μm, och en spets kona vinkel större än 10 grader.
   1. Borosilikatglas med en intern glödlampa med yttre diameter på 1,5 mm och inre diameter på 0,75 mm är väl lämpad för detta ändamål.
      1. Den relativt tjocka glaset ger en styvhet till spetsen.
      2. Den interna glödtråden är viktig i arbetet back-fylld vätska mot mikropipetten spetsen.
2. Tillverkning av lämpliga tips kommer ofta kräver flera ändringar baserat på observerade resultat. Olika vävnader kan kräva en spets med en något annorlunda form eller spets diameter.

Encelliga elektroporation protokoll:

För nya användare, är det lämpligt att börja med fluorescerande dextran färgämnen sedan, till skillnad från genetiskt kodade fluorescerande proteiner, kan de omedelbart ses under epifluorescence. Användning av fluorescerande färger ger användaren möjlighet att direkt se var de mikropipett spetsen inom mjukpapper, och på elektroporation ger direkt feedback på om utrustningen på rätt sätt har inrättats och om mikropipett tips är lämpligt.

1. Fyll mikropipett med lösning av substansen måste electroporated antingen med hjälp av en lastnings-spruta eller genom back-fyllning.
   1. Om du använder plasmid-DNA, se till att prover endotoxin-fri, och vid en koncentration mellan 1-2μg/ml, beredas i vatten.
   2. Koncentrationen av fluorescerande dextran färgämnen empiriskt bestämmas. Vi använder ofta fluorescerande färger utspätt i vatten till ca 300μM.
   3. Vanligtvis volymer av 0,5-1μl är tillräckliga.
   4. Före lastning, kort centrifug lösningar i hög hastighet för att minska mängden partiklar skräp sugs in i mikropipett, vilket kan leda till igensättning.
   5. Luftbubblor i spetsen påverkar ofta ström och bör lossna av kraftigt slår på mikropipett innan montering på headstage.
2. Sätt mikropipett i hållaren eller headstage monterad på en 3-axlig mikromanipulator. Se till att silvertråd elektrod sätts in mikropipett, och är i electrotonic kontakt med intern lösning.
3. Bedöva grodyngel genom nedsänkning i 0,02% MS-222 (3-aminobensoesyra etylester) upprättad i grodyngel uppfödning medium (Steinbergs, pH 7,4).
   1. Vi använder normalt stadium 44-48 albino Xenopus laevis grodyngel i våra experiment.
   2. Grodyngel är oftast helt bedövad efter ca 5 minuter.
   3. Flera yngel kan bedövas samtidigt för att minska vänta-tid, dock undvika exponering för MS-222 för perioder efter den 1 timme.
4. Överför en enda sövda grodyngel till elektroporation kammare med hjälp av en plast överföring mikropipett.
   1. Den elektroporation kammaren kan lätt göras i egen regi genom att snida ett grodyngel-formade hål i en liten Sylgard ® silikon block och infoga ett silver jordkabel i utrymmet så att det kommer att vara i electrotonic kontakt med grodyngel i kammaren.
5. Position grodyngel ryggsidan upp med en fuktad pensel.
6. Sänk mikropipett tills den är i kontakt med huden, i direkt anslutning till området av intresse.
   1. Inriktning regioner med tätt packade celler organ kommer att öka chanserna för en framgångsrik elektroporation.Vi riktar vanligtvis grodyngel optiska tectum.
   2. Ta mikropipett i en vinkel på 30 till 45 grader. Grundare banor gör huden punkteras svårare, medan brantare vinklar ofta hindra en uppfattning.
7. Fortsatt sänkning av mikropipett kommer initialt dimple huden, och sedan passera in i underliggande vävnad.
   1. Ytliga celler är att föredra för in vivo imaging, och kan riktas genom att säkerställa att mikropipett spetsen sänks långsamt vid dimpling av huden.
8. Man bör ständigt övervaka mikropipett motståndet gång placerade i vävnaden. Om du använder en Axoporator 800 A (Axon Instruments), motstånd på ca 10-40MΩ är optimala. Motstånd är en bra indikator på om spetsen diameter är lämplig för encelliga elektroporation.
   1. Hög mikropipett motstånd (> 100MΩ) indikerar igensatta tips eller mikropipetter med tips som är för smala.
   2. Låg mikropipett motstånd (<10MΩ) indikerar ett tips diameter som är för stort, ofta ett resultat av en trasig spets.
   3. Om du använder en stimulator som inte ger ett direkt motstånd åtgärd kan mikropipett motstånd indirekt mätta genom att observera amplitud spänningspulser mäts med oscilloskop (diskuteras nedan).
9. Applicera spänning tåg.
   1. För plasmid-DNA, tåg puls visat sig vara mest effektiva bestå av negativa fyrkantsvåg pulser 1ms i längd, levereras vid 300Hz med pulståg längd 500 ms.
      1. Pulsen Spänningen bestäms empiriskt så att amplituden av pulser mätt på oscilloskopet är mellan 0,75 och 1.5μA.
   2. För lysrör dextran färgämnen, är positiva fyrkantsvåg pulser 300μs varaktighet levereras med en frekvens på 300Hz med pulståg längd 10ms.
      1. Precis som med protokoll för DNA, är pulsen spänningen bestäms empiriskt så att amplituden av pulser mätt på oscilloskopet är mellan 0,75 och 1.5μA.
      2. Ytterligare justeringar av stimulans parametrar kan göras utifrån att observera resultaten av elektroporation i epifluorescence.
         1. Om electroporated celler verkar skumma, bör pulsparametrar gradvis tills cellerna ser ljusare ut.
         2. Å andra sidan, om kluster av celler är märkta, bör pulsparametrar reduceras tills enstaka celler är märkta.
10. Dra mikropipett, sätt tillbaka till en annan plats inom mjukpapper och lägg spänning tåg.
    1. För att förbättra avkastning, electroporate vi vanligtvis flera webbplatser i varje hemisfär av grodyngel optiska tectum med tillräckligt avstånd för att säkerställa att märkta celler inte överlappar varandra.
11. Överför electroporated grodyngel i en behållare med Steinbergs uppfödning lösning.
    1. Grodyngel kommer snabbt att återhämta sig från anestesi inom några minuter.
12. Samma mikropipett kan användas för många grodyngel. Det är viktigt att ständigt följa amplituden på pulser som observerats på oscilloskopet.
    1. Om pulsamplitud förblir låg efter att avsevärt öka pulsen intensiteten detta är sannolikt ett resultat av spetsen är igensatt, ofta ses när electroporating många grodyngel i ett sammanträde.
       1. En metod för att lossa en liten spets täppa är att tillämpa en enda positiv puls efter att föra in mikropipett i vävnaden.
       2. Om täppa inte kan rubbas eller igensättning ofta återkommer, byt mikropipetten.
    2. Om pulsamplitud fortfarande är mycket stort efter kraftigt minska pulsparametrar, är detta ett tecken på att toppen har sönder och behöver bytas ut.

Screening för att framgångsrikt electroporated celler:

1. Efter elektroporation är grodyngel screening för märkta celler med en upprätt epifluorescensmikroskop.
2. Vid fluorescerande färger kan yngel att visas efter att så lite som 30 minuter efter elektroporation.
   1. Vi har funnit dock att längre intervall är förknippade med lägre nivåer bakgrundsfluorescens.
3. För genetiskt kodade fluorescerande proteiner, är screening oftast genomfört minst 12 timmar efter elektroporation.
   1. Celler som uttrycker fluorescerande proteiner kommer att fortsätta att få ljusare med tiden, därför svagt celler får återanvändas skärmad efter ytterligare intervall på 12-24 timmar.
4. Grodyngel bedövas enligt ovan, placeras i en Sylgard ® kammare och täckas. Individuella grodyngel undersöks sedan i epifluorescence.
   1. Observera att överdriven exponering för epifluorescence ljus kommer att resultera i fototoxicitet som kan döda den märkta cellen. Därför minimera den tid som celler utsätts för lysrör.
5. Återgå grodyngel till behållare med Steinbergs uppfödning lösning.

Discussion

Encelliga elektroporation (SCE) är ett kraftfullt verktyg för att bestämma geners funktion och att utföra riktade genmanipulation. Öppenheten i albino grodyngel och tillgängligheten i hjärnan gör denna modell systemet idealiskt för att visualisera neuronala tillväxt och intracellulära händelser inom en levande organism. SCE tillåter visualisering av tillväxten av en enda neuron, och för att utföra cell-autonoma manipulationer inom en annars oförändrad hjärna. Även om denna video artikeln demonstrerar förfarandet för encelliga elektroporation i Xenopus laevis grodyngel, har denna teknik använts i andra organismer, och har även använts i hippocampus skivor och dissocierade cellkulturer.