Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Summary

Tek hücreli elektroporasyon (SCE), in vivo hazırlıkları da dahil olmak üzere sağlam doku içindeki tek tek hücrelerin içine DNA veya diğer makromoleküller teslim sağlayan özel bir tekniktir. Xenopus laevis larva bozulmamış beyin içinde nöronların bir floresan boya veya plazmid DNA SCE için burada ayrıntılarıyla prosedür.

Abstract

Tek hücreli elektroporasyon (SCE), in vivo hazırlıkları da dahil olmak üzere sağlam doku içindeki tek tek hücrelerin içine DNA veya diğer makromoleküller teslim sağlayan özel bir tekniktir. Bu tekniğin en belirgin avantajı, çevresindeki doku değişmeden bırakarak bu deneysel manipülasyonlar ve böylece küresel tedaviler sonucunda hücre özerk etkileri ayırt bireysel hücreleri üzerinde olabilir. Ileri in vivo görüntüleme teknikleri ile kombine edildiğinde, floresan belirteçlerin SCE hücresel morfoloji, hücre büyümesi ve hücre içi olayları saniye gün değişen zaman çizelgesi üzerinde doğrudan görselleştirme izin verir. Bu tekniği, in vivo ve ex vivo hazırlıkları içinde çeşitli olsa da, biz Xenopus laevis tetarlar kullanmak için bu tekniği optimize var. Bu video makalede, detaylı albino Xenopus larva bozulmamış beyin içinde nöronlar bir floresan boya veya plazmid DNA SCE prosedürü. Ayrıca verim optimize yöntemleri tartışmak ve canlı SCE tarafından floresan etiketli nöronlar iki foton floresan görüntüleme örnekler göstereceğiz.

Protocol

Ekipman set-up:

1. Bu teknik için gerekli elektrik ekipmanları, bir uyarıcıdır bir osiloskop ve gümüş tel mikropipet eklenecek ile donatılmış bir mikropipet sahibi. Biz genellikle bir Axon aletleri Axoporator 800A cihazın kullanımı, ancak bu Çim aletleri gibi diğer yaygın uyarıcıları SD9 uyarıcıları tek hücreli elektroporasyon için de uygundur. Cihazda dahili bir iletken solüsyon içeren cam mikropipet içine yerleştirilen gümüş tel elektrot ile arayüzleri headstage, bağlanır. Stimülatörü diğer kurşun tetra dış yerden giriş aldığı osiloskop girişi, bağlı. Tetra dış zemin elektroporasyon sırasında tetra electrotonic temas halinde kalan bir gümüş tel. Mikropipet larva ile temas konulduğunda devreyi tamamlamak.
   
   
2. Bu manevranın oda verir ve yaklaşık 30-45 derecelik bir açıyla mikropipet getirilerek sağlar yılından bu yana tek bir hücre elektroporasyon, iyi bir çalışma mesafesi (en az 5 cm) olan bir mikroskop gerektirir.

Mikropipetler Fabrikasyon:

Uygun mikropipetler hazırlanması, bu protokol için önemli bir adımdır. Buradaki zorluk, dar bir ucu (çapı 1 mikrona kadar) daha az doku delinmesiyle zaman kolayca kırmayacak bir dengeleme yatıyor. Ayrıca, 10 dereceden daha fazla bir konik açısı ile ipuçları çok tercih edildiğini bulduk.

1. 1 mikrona kadar daha az bir ucu çapı ve 10 dereceden daha fazla bir ucu konik açısı ile çekilmiş bir cam mikropipet hazırlayın.
   1. Dış çapı 1.5mm ve 0.75mm iç çapı ile bir iç filament borosilikat cam ve bu amaç için uygundur.
      1. Nispeten daha kalın bir cam ucu katılık derecesi sağlar.
      2. Iç filament mikropipet ucuna doğru geri-sıvı dolu çizim önemlidir.
2. Uygun ipuçları Fabrikasyon sıklıkla gözlenen sonuçların dayalı bazı değişiklikler gerekecektir. Farklı dokular, biraz daha farklı bir şekil veya bahşiş çapı bir ipucu isteyebilir.

Tek hücreli elektroporasyon protokolü:

Yeni kullanıcılar için, genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri aksine, onlar hemen Epifloresans altında görülebilir, çünkü floresan dekstran boyalar ile başlamak tavsiye edilir. Floresan boyaların kullanımı kullanıcının doğrudan doku içinde mikropipet ucunun yerini görmek için sağlar ve üzerine elektroporasyon ekipman düzgün mikropipet ucu uygun olup olmadığını kurmak ve olup olmadığını anında geri bildirim verir.

1. Mikropipet bir yükleme şırınga kullanarak veya arka doldurarak electroporated bileşik solüsyonu ile doldurun.
   1. Eğer plazmid DNA'sı kullanarak, suda hazırlanan örnekleri endotoksin ücretsiz olduğunu sağlamak ve 1-2μg/ml arasında bir konsantrasyon.
   2. Floresan dekstran boyaların konsantrasyonu ampirik olarak tespit edilmelidir. Biz sık sık su yaklaşık 300μM sulandırılmış floresan boya kullanın.
   3. Tipik olarak, 0.5-1μl hacimleri yeterlidir.
   4. Yüklemeden önce, kısaca tıkanmaya yol açabilir mikropipet, içine çekilir partikül enkaz miktarını azaltmak için yüksek hızda çözümler santrifüj.
   5. Ucu içinde hava kabarcıkları genellikle akım etkileyebilir ve şiddetle headstage, montaj öncesinde mikropipet Flicking yerinden olmalıdır.
2. Tutucunun içine mikropipet yerleştirin veya headstage, 3-eksen mikromanipülatör üzerine monte edilmiş. Mikropipet o gümüş tel elektrot yerleştirilir ve iç çözümü ile electrotonic temas içinde olduğunu emin olun.
3. Larva yetiştirme ortamı (Steinberg solüsyonu, pH 7.4) hazırlanan% 0,02 MS-222 (3-aminobenzoik asit etil ester) batırılarak tetarlar anestezisi.
   1. Biz normalde deneylerde evre 44-48 albino Xenopus laevis tetarlar kullanın.
   2. Tetarlar yaklaşık 5 dakika sonra genellikle tamamen anestezi.
   3. Çeşitli tetarlar bekleme süresini azaltmak için aynı anda narkoz olabilir, ancak 1 saat dışındaki süreler için MS-222 maruz kalmaktan kaçının.
4. Plastik bir transfer mikropipet kullanarak elektroporasyon odasına tek bir anestezi larva transferi.
   1. Elektroporasyon odası, küçük bir Sylgard ® silikon blok tetra-şekilli bir kavite, oyma ve gümüş bir topraklama kablosu takmadan odasında larva ile electrotonic temas halinde olacağı gibi boşluğuna kolayca ev yapılabilir.
5. Kullanılarak pozisyon larva dorsal tarafına fırça temizleyin.
6. Mikropipet, cilt ile temas halinde doğrudan ilgi bölgeye bitişik olduğu kadar düşürün.
   1. Yoğun dolu hücre gövdeleri bölgeleri hedeflemek, başarılı elektroporasyon şansını büyük ölçüde artıracaktır.Biz genellikle, tetra optik tectum hedef.
   2. 30 ila 45 derecelik bir açıyla mikropipet getirin. Dik açıları genellikle bir görüşü engelleyen ise, sığ yörüngeleri, cilt ponksiyon daha zor hale getirir.
7. Devamı mikropipet düşürücü cilt başlangıçta Köşelerini ve altta yatan doku içine geçmesine olacak.
   1. Yüzeysel hücreleri in vivo görüntüleme için tercih edilir ve mikropipet ucu cilt dimpling üzerine yavaş yavaş indirilir sağlamak hedeflenmiş olabilir.
8. Bir kez dokusu içinde yer mikropipet direnci sürekli izlemeniz gerekir. Eğer bir Axoporator 800A (Axon Instruments), yaklaşık 10-40MΩ dirençler kullanarak en uygun olan. Direnç ucu çapı tek hücreli elektroporasyon için uygun olup olmadığını iyi bir gösterge.
   1. Yüksek mikropipet dirençleri (> 100MΩ), çok dar ipuçları ile tıkanmış ip uçlarına ya da mikropipetler göstergesidir.
   2. Düşük mikropipet dirençleri (10M), genellikle, bir kırık ucu bir sonucu çok büyük bir ucu çapı göstergesidir.
   3. Doğrudan direncini ölçmek sağlamaz stimülatörü kullanıyorsanız, mikropipet direnç osiloskop (aşağıda) ele tarafından ölçülen gerilim darbeleri genliği gözlemleyerek dolaylı ölçülebilir.
9. Gerilim tren uygulayın.
   1. Plazmid DNA için, darbe, darbe tren süresi 500ms 300Hz'de teslim süresi 1ms negatif kare dalga bakliyat, oluşan en etkili olduğu tespit eğitir.
      1. Darbe gerilimi osiloskop ölçülen genlik bakliyat 0.75 ve 1.5μA arasında olduğunu ampirik gibi belirlenir.
   2. Floresan dekstran boyalar için, pozitif kare dalga darbeleri 300μs süresi 10ms darbe tren süresi ile 300Hz frekans teslim edilir.
      1. DNA protokol ile, darbe gerilimi osiloskop ölçülen genlik bakliyat 0.75 ve 1.5μA arasında olduğunu ampirik gibi belirlenir.
      2. Epifloresans altında elektroporasyon sonuçlarını gözlemleyerek dayalı uyaran parametrelerine ek ayarlamalar yapılabilir.
         1. Electroporated hücreler loş görünür hücreleri parlak görünene kadar, darbe parametreleri giderek artmış olmalıdır.
         2. Öte yandan hücre kümeleri etiketli, tek hücre etiketli kadar, darbe parametrelerin azaltılması olmalıdır.
10. Mikropipet geri çekin, doku içinde farklı bir site tekrar takın, ve gerilim tren uygulayın.
    1. Verimi artırmak için, biz genellikle o etiketli hücrelerin üst üste binmemesi sağlamak için yeterli boşluk ile larva optik tectum her yarımkürede birden fazla sitede electroporate.
11. Steinberg yetiştirme çözümü ile bir kap içine electroporated larva transferi.
    1. Tetarlar anestezi birkaç dakika içinde hızla iyileşir.
12. Aynı mikropipet sayısız iribaşların kullanılabilir. Osiloskop gözlenen bakliyat genliği sürekli gözlemlemek önemlidir.
    1. Darbe genlik darbe yoğunluğu önemli ölçüde artan sonra düşük kalırsa, bu durum, bir oturuşta birçok tetarlar electroporating sık görülen tıkanmış olan ucu, bir sonucudur.
       1. Küçük bir ipucu yapışmasına neden çıkarmak için kullanılan bir yöntem, doku içine mikropipet yerleştirdikten sonra tek bir pozitif darbe uygulamaktır.
       2. Yapışmasına neden yerinden ya da sık sık kendini yinelemektedir tıkanma değil, mikropipet değiştirin.
    2. Darbe genlik nabız parametrelerini önemli ölçüde azalan sonra çok büyük kalırsa, bu, ucu kırık olduğunu ve değiştirilmesi gerekir bir işaretidir.

Başarıyla electroporated hücreler için Gösterimi:

1. Elektroporasyon sonra, tetarlar Epifloresans dik bir mikroskop kullanılarak etiketli hücreler için taranmaktadır.
2. Floresan boyaların durumda, en az 30 dakika sonrası elektroporasyon tetarlar sonra gösterilebilir.
   1. Biz daha uzun aralıklarla düşük eşiğe düzeyleri ile ilişkili olduğunu, ancak bulduk.
3. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri için, tarama genellikle en az 12 saat sonrası elektroporasyon yapılır.
   1. Floresan proteinlerle ifade hücreler zamanla parlak almaya devam edecektir, bu yüzden loş hücreleri 12-24 saat ek bir aradan sonra yeniden gösterildi olabilir.
4. Sylgard ® odasında yerleştirilen, yukarıda açıklanan ve dakika muamele tetarlar anestezi. Bireysel tetarlar sonra Epifloresans altında incelenir.
   1. Epifloresans ışığa aşırı derecede maruz etiketli hücre öldürebilir fototoksisite neden olacağını unutmayın. Bu nedenle, floresan ışık hücrelerinin maruz kaldığı süreyi en aza indirir.
5. Steinberg yetiştirme çözümü ile konteyner tetarlar dönün.

Discussion

Tek hücreli elektroporasyon (SCE), gen fonksiyonu belirleyen ve hedeflenen genetik manipülasyon yapmak için güçlü bir araçtır. Albino larva şeffaflık ve beyin erişilebilirlik Bu model sistem canlı bir organizma içinde nöronal büyüme ve hücre içi olayları görselleştirmek için ideal olun. SCE, tek bir nöronun büyüme görselleştirme izin verir, ve aksi halde değiştirilmemiş beynin içinde hücre özerk manipülasyonlar gerçekleştirebilirsiniz. Bu video makale Xenopus laevis tetarlar tek hücreli elektroporasyon için prosedür gösteriyor olsa da, bu tekniğin diğer organizmalar, ve hipokampal dilimleri ve ayrışmış bir hücre kültürleri de kullanılır olmuştur.