在体内的单细胞电穿孔内完整的大脑发育

Summary

单细胞电（SCE）是一个专门的技术，允许交付到单个细胞内完整的组织，在体内的准备工作，包括的DNA或其他大分子。在这里，我们标准煤荧光染料或成爪蟾蝌蚪的完整的大脑内的神经细胞的质粒DNA的详细过程。

Abstract

单细胞电（SCE），是一家专业的技术，使DNA或其他大分子成单个细胞内完整的组织，在体内的准备工作，包括交付。这项技术的独特优势是，实验操作，可对单个细胞，同时使周围组织保持不变，从而区别于那些导致全球治疗的细胞自主的效果。拥有先进的体内成像技术相结合时，荧光标记标准煤许可证的细胞形态，细胞生长，细胞内事件从几秒钟到几天不等的时间尺度，直接可视化。虽然这种技术是使用各种在体内和体外的准备，我们在爪蟾蝌蚪的使用这种技术进行了优化。在这个视频文章中，我们详细标准煤荧光染料或白化非洲爪蟾蝌蚪的完整的大脑内的神经细胞的质粒DNA的过程。我们还讨论了方法，以优化产量，并显示由SCE荧光标记的神经元的活的双光子荧光成像的例子。

Protocol

设备设置：

1. 这种技术所需的电气设备是一个刺激器，示波器和微量架配有一个银色的线插入到微。我们通常使用一个轴突文书Axoporator 800A刺激，但如草文书等共同刺激SD9刺激，也适用于单细胞电穿孔。刺激器的探头，放在里面的玻璃内部进行解决方案含有微量的银线电极接口连接。从刺激导致连接到示波器的输入端，还接收来自外部的蝌蚪地面的输入。蝌蚪外部接地电紧张的蝌蚪在电接触仍然是一个简单的银线。该电路是完整的，一旦微量接触蝌蚪。
   
   
2. 单细胞电需要一个良好的工作距离（至少5厘米）的显微镜，因为这给了回旋的余地，并允许在约30-45度的角度带来的微量。

制备微量：

适当微量的制备是在这个协议中的一个关键的一步。困难在于，一个狭窄的尖端（直径小于1微米）平衡，不会轻易打破穿刺组织时。我们还发现，一个大于10度的锥度角的秘诀是可取的。

1. 准备一把拉住玻璃微吸管尖端直径小于1μm的，和一个大于10度的尖端锥度。
   1. 硼硅玻璃与内部灯丝外径1.5mm和内在0.75毫米直径非常适合用于这一目的。
      1. 比较厚的玻璃提供了一定程度的刚性给小费。
      2. 在制订对微量尖回填流体内部的灯丝是很重要的。
2. 制造适当的提示，往往需要若干修改的基础上观察到的结果。不同的组织可能需要一个稍微不同的形状，或尖端直径的提示。

单细胞电协议：

对于新用户，最好是开始与右旋糖酐荧光染料，不像荧光蛋白基因编码的，因为他们可以立即根据epifluorescence看到。使用荧光染料，使用户能够直接看到组织内的微管尖端的位置，并经电提供设备是否已正确设置和微量提示是否是合适的即时反馈。

1. 填充微量的复合解决方案，通过使用装载注射器或回填电穿孔。
   1. 如果使用质粒DNA，确保样品无内毒素，并在浓度之间1-2μg/ml，在水中准备。
   2. 荧光葡聚糖染料的浓度应凭经验确定。我们经常使用的荧光染料，加水稀释至约300μM。
   3. 通常情况下，0.5 -1μl进卷就足够了。
   4. 装货前，短暂离心高速的解决方案，以减少颗粒碎片绘制成微管，这可能会导致堵塞。
   5. 气泡内提示，往往会影响电流的流动，应大力弹的微量探头安装前脱落。
2. 插入持有微量或探头上安装一个3轴显微。确保，银线电极插入微管，电紧张与内部的解决方案接触。
3. 麻醉浸泡在0.02％蝌蚪饲养中期（Steinberg的溶液，pH 7.4）编写的MS - 222（3 - 氨基甲酸乙酯）蝌蚪。
   1. 我们通常使用在我们的实验阶段44-48白化非洲爪蟾蝌蚪。
   2. 蝌蚪通常大约5分钟后完全麻醉。
   3. 然而，几个蝌蚪，可能是麻醉的同时，以减少等待时间，避免接触超过1小时，期间到MS - 222。
4. 一个单一的麻醉蝌蚪电室使用塑料转移微量。
   1. 电室，可以很容易地在内部雕刻一个蝌蚪形的空腔，在一个小Sylgard ®硅块和插入一个银色的接地线腔等，将在电紧张的联系与蝌蚪在会议厅内。
5. 蘸位置蝌蚪了背侧使用画笔。
6. 下的微管，直到它与皮肤接触，直接相邻地区的利益。
   1. 针对密密麻麻的细胞机构的地区，将大大增加成功的电击机会。通常，我们的目标蝌蚪视神经顶盖。
   2. 在微量带来30至45度角。较浅的轨迹使皮肤穿刺比较困难，而陡峭的角度往往阻碍一个人的看法。
7. 继续降低微量最初将酒窝的皮肤，然后通过到底层的组织。
   1. 表层细胞在活体成像的首选，并可以通过有针对性的确保慢慢降低后的皮肤凹陷，微管尖端。
8. 一是要不断监察一旦组织内放置的微量阻力。如果使用Axoporator 800A（Axon仪器），约10 -40MΩ的电阻是最优的。阻力是尖端直径是否适合于单细胞电穿孔的良好指标。
   1. 高微量电阻（>100MΩ）堵塞提示或技巧，过于狭窄的微量指示。
   2. 低微量电阻（<10MΩ）是一个尖端直径太大，往往是一个破碎的一角的结果的指示。
   3. 如果使用的是一个刺激，不提供直接的电阻测量，微管阻力，可以间接地通过观察示波器测量的电压脉冲（下面讨论）的振幅来测量。
9. 应用电压列车。
   1. 质粒DNA，脉冲序列的发现，最有效的负方波脉冲持续时间为1ms，在300Hz脉冲500ms的火车时间交付，包括。
      1. 凭经验确定示波器测得的脉冲幅度介于0.75和1.5μA的脉冲电压。
   2. 对于葡聚糖荧光染料，提供积极的方波脉冲持续时间为300μs，在300Hz的频率与脉冲持续时间为10ms的火车。
      1. 至于协议的DNA，脉冲电压是凭经验确定示波器测得的脉冲幅度介于0.75和1.5μA。
      2. 下epifluorescence电观测结果的基础上，可进一步调整刺激参数。
         1. 如果电穿孔细胞出现暗淡，脉冲参数应逐步增加，直到细胞显得更亮。
         2. 另一方面，如果被标记的细胞群，脉冲参数应减少直至单个细胞标记。
10. 缩回微管，重新插入到一个组织内的不同的网站，并施加电压的列车。
    1. 为了提高产量，我们通常electroporate在每个半球有足够的间距蝌蚪视神经顶盖多个站点，标记的细胞，以确保不重叠。
11. 与Steinberg的饲养解决方案的容器转移到电穿孔蝌蚪。
    1. 蝌蚪会迅速恢复在几分钟内麻醉。
12. 相同的微管可用于许多蝌蚪。重要的是要不断观察示波器上观察到的脉冲幅度。
    1. 如果脉冲幅度显着提高脉冲强度后仍然偏低，这可能是一个被堵塞的一角，电穿孔许多蝌蚪在一次会议时，经常看到的结果。
       1. 撞出一个小的提示阻塞的一种方法是申请一个正脉冲，后插入的微管组织。
       2. 如果堵塞不能脱落，或堵塞频繁复发，更换微管。
    2. 后，大大减少了脉冲参数，如果脉冲幅度仍然非常大，这是一个提示已损坏，需要更换的迹象。

成功的电穿孔细胞的筛选：

1. 电击后，蝌蚪使用一个堂堂正正的epifluorescence显微镜标记的细胞筛选。
2. 在荧光染料的情况下，蝌蚪可筛选后短短30分钟后电。
   1. 然而，我们发现较长的时间间隔与背景荧光的水平降低有关。
3. 对于荧光蛋白基因编码，筛选通常是进行电后至少12小时。
   1. 荧光蛋白的表达，将继续得到美好的时间，因此昏暗的细胞可能会重新筛选后12-24小时的额外时间间隔。
4. 蝌蚪麻醉如上所述，放置在一个Sylgard ®厅和coverslipped。个别蝌蚪，然后根据epifluorescence检查。
   1. 请注意，过度暴露于epifluorescence光会导致光毒性，可能会杀死标记细胞。因此，最大限度地减少，细胞暴露在荧光灯的时间量。
5. 返回蝌蚪容器与Steinberg的饲养解决方案。

Discussion

单细胞电（SCE）是一个强大的工具用于确定基因功能，并进行有针对性的基因操纵。白化蝌蚪的透明度和大脑的辅助功能，使这个模型系统，非常适合用于可视化的神经细胞生长和细胞内事件，在活的有机体。 SCE允许可视化的单个神经元的生长，并执行一个不变的大脑内的细胞自主操作。虽然这种视频文章演示了单细胞电在爪蟾蝌蚪的过程，这种技术已被用于在其他生物中，也一直在海马脑片和游离细胞培养使用。