Biology

सिंगल सेल electroporation vivo में बरकरार विकासशील मस्तिष्क के भीतर

Published: July 11, 2008 doi: 10.3791/705

D. Sesath Hewapathirane^1,2, Kurt Haas^1,2

¹Brain Research Centre, University of British Columbia - UBC, ²Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia - UBC

Summary

एकल सेल electroporation SCE () में vivo तैयारी में सहित बरकरार ऊतक के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं में डीएनए या अन्य बड़े अणुओं के वितरण की अनुमति एक विशेष तकनीक है. यहाँ एक फ्लोरोसेंट डाई या Xenopus laevis मेढक का डिंभकीट के बरकरार मस्तिष्क के भीतर न्यूरॉन्स में प्लास्मिड डीएनए के SCE के लिए हम प्रक्रिया विस्तार.

Abstract

एकल सेल electroporation SCE () में vivo तैयारी में सहित बरकरार ऊतक के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं में डीएनए या अन्य बड़े अणुओं के वितरण की अनुमति एक विशेष तकनीक है. इस तकनीक का विशिष्ट लाभ है कि प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती व्यक्ति की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है जबकि आसपास के ऊतकों अनछुए जा, जिससे वैश्विक उपचार से उत्पन्न उन लोगों से सेल स्वायत्त प्रभाव भेद. जब vivo इमेजिंग तकनीक में उन्नत के साथ संयुक्त, फ्लोरोसेंट मार्करों के SCE सेलुलर आकारिकी, सेल के विकास, और सेकंड से दिनों से लेकर timescales पर intracellular घटनाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट. हालांकि इस तकनीक vivo और पूर्व vivo तैयारी में की एक किस्म में प्रयोग किया जाता है, हम Xenopus laevis tadpoles में इस्तेमाल के लिए इस तकनीक अनुकूलित है. इस वीडियो लेख में, हम एक फ्लोरोसेंट डाई या विवर्ण Xenopus मेढक का डिंभकीट के बरकरार मस्तिष्क के भीतर न्यूरॉन्स में प्लास्मिड डीएनए के SCE के लिए प्रक्रिया विस्तार. हम भी तरीके चर्चा करने के लिए उपज अनुकूलन, और रहते fluorescently SCE द्वारा लेबल न्यूरॉन्स के दो photon प्रतिदीप्ति इमेजिंग के उदाहरण दिखा.

Protocol

सेट - अप उपकरण:

बिजली इस तकनीक के लिए आवश्यक उपकरण एक उत्तेजक, एक आस्टसीलस्कप है, और एक micropipette एक चांदी का तार के साथ micropipette में सम्मिलित किया जा फिट धारक हैं. आम तौर पर हम एक Axon उपकरणों Axoporator 800A उत्तेजक औधधि का उपयोग करने के लिए, लेकिन घास उपकरणों जैसे अन्य आम stimulators SD9 stimulators भी एकल कक्ष electroporation के लिए उपयुक्त हैं. उत्तेजक औधधि headstage है, जो एक आंतरिक आयोजन समाधान युक्त गिलास micropipette के अंदर रखा जा चांदी के तार इलेक्ट्रोड के साथ इंटरफेस करने के लिए जुड़ा हुआ है. उत्तेजक औधधि से अन्य नेतृत्व आस्टसीलस्कप इनपुट, जो भी मेढक का डिंभकीट बाहरी जमीन से इनपुट प्राप्त करने के लिए जुड़ा हुआ है. मेढक का डिंभकीट बाहरी जमीन बस एक चांदी के तार electroporation दौरान मेढक का डिंभकीट के साथ electrotonic संपर्क में रहता है. सर्किट पूरा हो गया है एक बार micropipette मेढक का डिंभकीट के साथ संपर्क में रखा गया है.
सिंगल सेल electroporation एक अच्छा काम कर दूरी (कम से कम 5cm) के साथ एक खुर्दबीन की आवश्यकता होती है, के बाद से इस पैंतरेबाज़ी के लिए कमरे देता है और micropipette के बारे में 30-45 डिग्री के कोण पर में लाया की अनुमति देता है.

Micropipettes का निर्माण कार्य:

उपयुक्त micropipettes तैयार इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है. कठिनाई है कि आसानी से नहीं टूटेगा जब ऊतक puncturing के साथ एक संकीर्ण टिप (कम से कम व्यास में 1μm) संतुलन में निहित है. हम यह भी पाया है कि अधिक से अधिक 10 डिग्री की एक घटना के कोण के साथ युक्तियाँ बेहतर कर रहे हैं.

1μm कम से कम एक टिप व्यास, और अधिक से अधिक 10 डिग्री की एक टिप शंकु कोण के साथ एक खींच कांच micropipette तैयार करें.
1. 0.75mm 1.5mm और भीतरी व्यास के बाहरी व्यास के साथ एक आंतरिक फिलामेंट के साथ borosilicate ग्लास अच्छी तरह से इस प्रयोजन के लिए उपयुक्त है.
  1. अपेक्षाकृत मोटी कांच टिप करने के लिए कठोरता की एक डिग्री प्रदान करता है.
  2. आंतरिक फिलामेंट micropipette सिरे की ओर वापस भरे द्रव ड्राइंग में महत्वपूर्ण है.
उपयुक्त सुझावों का निर्माण कार्य अक्सर मनाया परिणामों पर आधारित कई संशोधनों की आवश्यकता होगी. विभिन्न ऊतकों एक से थोड़ा अलग आकृति या टिप व्यास के साथ एक टिप की आवश्यकता हो सकती है.

सिंगल सेल electroporation प्रोटोकॉल:

नए उपयोगकर्ताओं के लिए, यह सलाह दी जाती है फ्लोरोसेंट dextran रंगों के साथ शुरू के बाद से, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विपरीत, वे तुरंत epifluorescence के अंतर्गत देखा जा सकता है. फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग उपयोगकर्ता सीधे ऊतक के भीतर micropipette टिप के स्थान को देखने के लिए सक्षम बनाता है, और पर electroporation कि उपकरण ठीक से किया गया है स्थापित और क्या micropipette टिप उपयुक्त है के रूप में तत्काल प्रतिक्रिया देता है.

परिसर के समाधान के लिए एक लोडिंग सिरिंज का उपयोग कर या वापस भरने के द्वारा electroporated के साथ micropipette भरें.
1. यदि प्लास्मिड डीएनए का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए, कि नमूने endotoxin मुक्त हैं, और 1-2μg/ml के बीच एक एकाग्रता में, पानी में तैयार.
2. फ्लोरोसेंट dextran रंगों की एकाग्रता empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. हम अक्सर उपयोग फ्लोरोसेंट रंजक पानी में लगभग 300μM पतला.
3. आमतौर पर 0.5 1μl की मात्रा पर्याप्त हैं.
4. लोड हो रहा है पहले, संक्षेप में उच्च गति पर समाधान अपकेंद्रित्र micropipette, जो clogging के लिए नेतृत्व कर सकते में तैयार कण मलबे की राशि कम है.
5. टिप के भीतर वायु बुलबुले अक्सर वर्तमान प्रवाह को प्रभावित और सख्ती micropipette पहले flicking headstage पर बढ़ते से उखाड़ फेंकना किया जाना चाहिए.
धारक में micropipette सम्मिलित करें या headstage एक 3 अक्ष micromanipulator पर घुड़सवार. सुनिश्चित करें कि चांदी के तार इलेक्ट्रोड micropipette में डाला जाता है, और आंतरिक समाधान के साथ electrotonic संपर्क में है.
विसर्जन द्वारा 0.02% MS-222 (3 aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर) मेढक का डिंभकीट पालन मध्यम (स्टाइनबर्ग के समाधान, पीएच 7.4) में तैयार में tadpoles anesthetize.
1. हम आम तौर पर हमारे प्रयोगों में चरण 44-48 विवर्ण Xenopus laevis tadpoles का उपयोग करें.
2. Tadpoles आमतौर पर लगभग 5 मिनट के बाद पूरी तरह से anesthetized हैं.
3. कई tadpoles anesthetized एक साथ होने के लिए प्रतीक्षा समय को कम कर सकते हैं, तथापि, MS-222 के लिए 1 घंटे से परे अवधि के लिए जोखिम से बचने.
Electroporation चैम्बर के लिए एक एकल anesthetized मेढक का डिंभकीट स्थानांतरण एक प्लास्टिक हस्तांतरण micropipette का उपयोग कर.
1. electroporation चैम्बर आसानी से एक छोटे ® Sylgard सिलिकॉन ब्लॉक में एक मेढक का डिंभकीट के आकार गुहा नक्काशी, और ऐसी है कि यह electrotonic संपर्क में चैम्बर में मेढक का डिंभकीट के साथ किया जाएगा गुहा में एक चांदी जमीन तार डालने से घर में बनाया जा सकता है.
एक का उपयोग कर स्थिति मेढक का डिंभकीट पृष्ठीय पक्ष तूलिका सिक्त.
लोअर micropipette जब तक यह त्वचा के साथ संपर्क में है, सीधे हित के क्षेत्र के निकट है.
1. घनी पैक सेल शरीर के साथ क्षेत्रों को लक्षित बहुत सफल electroporation की संभावना बढ़ जाएगी.हम आम तौर पर मेढक का डिंभकीट ऑप्टिक tectum लक्ष्य.
2. 30 से 45 डिग्री के कोण पर में micropipette लाओ. Shallower trajectories त्वचा पंचर और अधिक मुश्किल बना है, जबकि steeper कोण अक्सर एक दृश्य में बाधा डालती.
Micropipette के लगातर कम शुरू में त्वचा हिलकोरे होगा, और तब अंतर्निहित ऊतकों में के माध्यम से गुजरती हैं.
1. सतही कोशिकाओं vivo इमेजिंग में के लिए पसंद कर रहे हैं, और सुनिश्चित करना है कि micropipette टिप धीरे त्वचा के dimpling पर उतारा है द्वारा लक्षित किया जा सकता है.
एक लगातार micropipette एक बार ऊतक के भीतर रखा प्रतिरोध निगरानी करनी चाहिए. यदि एक Axoporator 800A (Axon उपकरण), लगभग 10 40MΩ resistances का उपयोग इष्टतम हैं. प्रतिरोध कि टिप व्यास एकल कोशिका electroporation के लिए उपयुक्त है की एक अच्छा संकेत है.
1. उच्च micropipette resistances (100MΩ>) सुझाव है कि बहुत संकीर्ण हैं के साथ भरा सुझावों या micropipettes के संकेत हैं.
2. कम micropipette resistances (<10MΩ) कोई टिप व्यास है कि बहुत बड़ी है, अक्सर एक टूटी हुई टिप का एक परिणाम के संकेत हैं.
3. यदि एक उत्तेजक औधधि है कि एक प्रत्यक्ष प्रतिरोध उपाय प्रदान नहीं करता है का उपयोग, micropipette प्रतिरोध परोक्ष रूप से आस्टसीलस्कप (नीचे) पर चर्चा के द्वारा मापा वोल्टेज दालों के आयाम देख द्वारा मापा जा सकता है.
ट्रेन वोल्टेज लागू.
1. प्लास्मिड डीएनए के लिए, नाड़ी सबसे नकारात्मक वर्ग तरंग अवधि में 1ms दालों, 500ms की नाड़ी ट्रेन की अवधि के साथ 300Hz पर दिया मिलकर प्रभावी हो पाया गाड़ियों.
  1. पल्स वोल्टेज empirically ऐसी है कि आस्टसीलस्कप पर मापा दालों के आयाम के बीच 0.75 और 1.5μA है निर्धारित किया जाता है.
2. फ्लोरोसेंट dextran रंजक के लिए, सकारात्मक 300μs अवधि के वर्ग तरंग दालों 300Hz के एक आवृत्ति पर नाड़ी 10ms की ट्रेन की अवधि के साथ वितरित कर रहे हैं.
  1. डीएनए के लिए प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, पल्स वोल्टेज empirically ऐसी है कि आस्टसीलस्कप पर मापा दालों के आयाम के बीच 0.75 और 1.5μA है निर्धारित किया जाता है.
  2. उत्तेजना मापदंडों को अतिरिक्त समायोजन epifluorescence के तहत electroporation की परिणामों के अवलोकन के आधार पर बनाया जा सकता है है.
    1. यदि electroporated कोशिकाओं धुंधला दिखाई देते हैं, नाड़ी मापदंडों धीरे धीरे जब तक कोशिकाओं उज्जवल दिखाई देते हैं वृद्धि हुई है चाहिए.
    2. दूसरी ओर, यदि कोशिकाओं के समूहों में चिह्नित कर रहे हैं, नाड़ी मापदंडों जब तक एकल कक्षों में चिह्नित कर रहे हैं कम किया जाना चाहिए.
Micropipette वापस लेना करने के लिए, ऊतक के भीतर एक अलग साइट में फिर से सम्मिलित करते हैं, और वोल्टेज ट्रेन लागू होते हैं.
1. उपज में सुधार करने के लिए, हम आमतौर पर पर्याप्त अंतर के साथ मेढक का डिंभकीट ऑप्टिक tectum प्रत्येक गोलार्द्ध में एकाधिक साइटों electroporate करने के लिए सुनिश्चित करें कि लेबल कोशिकाओं को ओवरलैप नहीं है.
स्टाइनबर्ग पालन समाधान के साथ एक कंटेनर में electroporated मेढक का डिंभकीट स्थानांतरण.
1. Tadpoles तेजी से कुछ ही मिनटों के भीतर संज्ञाहरण से में ठीक हो जाएगी.
उसी micropipette कई tadpoles के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लगातार आस्टसीलस्कप पर मनाया दालों के आयाम का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
1. यदि स्पंद आयाम काफी पल्स तीव्रता में वृद्धि के बाद कम रहता है इस संभावना टिप भरा जा रहा है, अक्सर देखा है जब एक बैठक में कई tadpoles electroporating के एक परिणाम है.
  1. एक विधि के लिए एक छोटी सी टिप रोकना बेदखल ऊतक में micropipette डालने के बाद एक सकारात्मक स्पंद लागू है.
  2. यदि रोकना नहीं किया जा उखाड़ फेंकना कर सकते हैं या अक्सर recurs clogging, micropipette जगह.
2. यदि स्पंद आयाम काफी कम नाड़ी मापदंडों के बाद बहुत बड़े रहता है, यह एक संकेत है कि टिप और टूटी हुई है और जगह की जरूरत है.

सफलतापूर्वक electroporated कोशिकाओं के लिए स्क्रीनिंग:

Electroporation के बाद, tadpoles लेबल एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं के लिए जांच कर रहे हैं.
फ्लोरोसेंट रंजक के मामले में, tadpoles के रूप में छोटे रूप में 30 के बाद electroporation मिनट के बाद जांच की जा सकता है.
1. हमने पाया है, तथापि, कि अब अंतराल कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर के साथ जुड़े रहे हैं.
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग आम तौर पर कम से कम 12 के बाद electroporation घंटे आयोजित किया जाता है.
1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को समय के साथ चमक पाने के लिए जारी होगा, इसलिए मंद कोशिकाओं को हो सकता है 12-24 घंटे की एक अतिरिक्त अंतराल के बाद फिर से जांच की.
Tadpoles anesthetized कर रहे हैं के रूप में ऊपर वर्णित है, एक Sylgard ® कक्ष में रखा और coverslipped. व्यक्तिगत tadpoles तो epifluorescence के तहत जांच कर रहे हैं.
1. ध्यान दें कि epifluorescence प्रकाश के लिए अत्यधिक जोखिम phototoxicity में परिणाम होगा कि लेबल सेल को मार सकता है. इसलिए, समय की राशि है कि कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रोशनी को उजागर कर रहे हैं कम से कम.
स्टाइनबर्ग पालन समाधान के साथ कंटेनर के लिए tadpoles लौटें.

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Discussion

एकल सेल electroporation SCE () जीन समारोह का निर्धारण और लक्षित आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. सूरजमुखी मनुष्य मेढक का डिंभकीट की पारदर्शिता और मस्तिष्क की पहुंच इस मॉडल आदर्श neuronal और एक जीवित जीव के भीतर विकास और intracellular घटनाओं visualizing के लिए उपयुक्त प्रणाली बनाते हैं. SCE एक न्यूरॉन के विकास के दृश्य की अनुमति देता है, और एक अन्यथा अनछुए मस्तिष्क के भीतर सेल स्वायत्त जोड़तोड़ प्रदर्शन. इस वीडियो लेख Xenopus laevis tadpoles में एकल कक्ष electroporation के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है, जबकि अन्य जीवों में इस तकनीक का इस्तेमाल किया गया है, और hippocampal स्लाइसें और अलग सेल संस्कृतियों में भी इस्तेमाल किया गया है.

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Acknowledgments

लेखकों SCE micromicropipette सुझावों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए फिल्म समय चूक एक अपरिपक्व न्यूरॉन और डेरेक Dunfield कैप्चरिंग विकास के लिए Sharmin हुसैन धन्यवाद.

References

Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).
Dunfield, D., Haas, K. Single cell electroporation. Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.
Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).