Cella singola elettroporazione in vivo all'interno del cervello intatto in via di sviluppo

Summary

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è una tecnica specializzata che consente la consegna di DNA o di altre macromolecole in singole celle all'interno del tessuto intatto, anche in preparati in vivo. Qui dettaglio la procedura di SCE di un colorante fluorescente o DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello intatto della Xenopus laevis girino.

Abstract

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è una tecnica specializzata che consentono la fornitura di DNA o di altre macromolecole in singole celle all'interno del tessuto intatto, anche in preparati in vivo. Il vantaggio di questa tecnica è che le manipolazioni sperimentali può essere eseguita su singole cellule, lasciando inalterato il tessuto circostante, in modo da distinguere cellule effetti autonomi e da quelli risultanti da trattamenti globali. Se combinati con avanzate tecniche di imaging in vivo, SCE di marcatori fluorescenti permette la visualizzazione diretta della morfologia cellulare, la crescita cellulare, ed eventi intracellulari su scale temporali che variano da secondi a giorni. Mentre questa tecnica è utilizzata in una varietà di preparati in vivo ed ex vivo, abbiamo ottimizzato questa tecnica per l'utilizzo in girini Xenopus laevis. In questo articolo video, abbiamo dettaglio la procedura di SCE di un colorante fluorescente o DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello intatto l'albino Xenopus girino. Abbiamo anche discutere i metodi per ottimizzare la resa, e mostrare esempi di vivere a due fotoni imaging di fluorescenza dei neuroni fluorescente da SCE.

Protocol

Attrezzature di set-up:

1. Le apparecchiature elettriche richieste per questa tecnica sono uno stimolatore, un oscilloscopio e un supporto micropipetta dotato di un filo d'argento per essere inserito nella micropipetta. Usiamo tipicamente un assone strumenti Axoporator 800A stimolatore, tuttavia altri stimolatori comuni come gli strumenti Grass SD9 stimolatori sono adatti anche per singola cellula elettroporazione. Lo stimolatore è collegato al headstage, che si interfaccia con l'elettrodo filo d'argento per essere collocato all'interno del micropipetta di vetro contenente una soluzione interna direzione d'orchestra. Il piombo altri lo stimolatore è collegata all'ingresso oscilloscopio, che riceve in ingresso anche da terra girino esterno. Il terreno girino esterno è semplicemente un filo d'argento che rimane in contatto con il elettrotonici girino durante elettroporazione. Il circuito è completo una volta che la micropipetta viene posto in contatto con il girino.
   
   
2. Elettroporazione singola cellula richiede un microscopio con una buona distanza di lavoro (almeno 5cm), dal momento che questo dà spazio di manovra e permette la micropipetta di essere portato in un angolo di circa 30-45 gradi.

Fabbricazione di micropipette:

Preparazione di micropipette appropriato è un passo fondamentale in questo protocollo. La difficoltà sta nel bilanciare una punta stretta (meno di 1μm di diametro) con uno che non sarà facile rompere quando si fora il tessuto. Abbiamo anche scoperto che le punte con un angolo di cono maggiore di 10 gradi sono preferibili.

1. Preparare una micropipetta di vetro tirato con una punta di diametro inferiore a 1μm, e un angolo di punta del cono superiore a 10 gradi.
   1. Vetro borosilicato con un filamento interno con diametro esterno di 1,5 mm e diametro interno di 0,75 mm è adatto per questo scopo.
      1. Il vetro relativamente spesso fornisce un grado di rigidità alla punta.
      2. Il filamento interno è importante per l'elaborazione di back-riempiti liquido verso la punta micropipetta.
2. Fabbricazione di punte adatte spesso richiede alcune modifiche sulla base dei risultati osservati. Diversi tessuti possono richiedere una punta con una forma leggermente diversa o diametro della punta.

Elettroporazione di singole cellule protocollo:

Per i nuovi utenti, è consigliabile iniziare con tinture fluorescenti destrano poiché, a differenza geneticamente codificato proteine ​​fluorescenti, possono essere viste immediatamente in epifluorescenza. Uso di coloranti fluorescenti permette all'utente di vedere direttamente la posizione della punta della micropipetta all'interno del tessuto, e su elettroporazione dà un feedback immediato sul fatto che l'apparecchiatura è stata impostata correttamente e se la punta della micropipetta è appropriato.

1. Riempire micropipetta con una soluzione di composto da elettroporate mediante l'utilizzo di una siringa di carico o di back-filling.
   1. Se si utilizza DNA plasmidico, affinché i campioni siano endotossina-free, e ad una concentrazione tra 1-2μg/ml, preparati in acqua.
   2. La concentrazione di coloranti fluorescenti destrano dovrebbe essere empiricamente determinato. Spesso usiamo coloranti fluorescenti diluito in acqua a circa 300μM.
   3. Tipicamente, i volumi di 0,5-1ml sono sufficienti.
   4. Prima di essere caricato, centrifugare brevemente le soluzioni ad alta velocità per ridurre la quantità di residui particolati trascinati nella micropipetta, che possono portare all'ostruzione.
   5. Le bolle d'aria all'interno della punta spesso colpiscono il flusso di corrente e dovrebbero essere soppiantate da vigorosamente sfogliando la micropipetta prima del montaggio sul headstage.
2. Inserire nel supporto micropipetta o headstage montato su un 3-asse micromanipolatore. Assicurarsi che l'elettrodo filo d'argento è inserito nel micropipetta, ed è in contatto elettrotonici con la soluzione interna.
3. Anestetizzare girini per immersione in 0,02% MS-222 (3-aminobenzoico etil estere) preparati in media allevamento girino (soluzione di Steinberg, pH 7,4).
   1. Normalmente usiamo stadio 44-48 albino Xenopus laevis girini nei nostri esperimenti.
   2. Girini di solito sono completamente anestetizzati dopo circa 5 minuti.
   3. Girini Numerosi possono essere anestetizzati contemporaneamente per ridurre il tempo di attesa, tuttavia, evitare l'esposizione a MS-222 per periodi oltre 1 ora.
4. Trasferire un girino solo anestetizzati alla camera di elettroporazione utilizzando una micropipetta di plastica di trasferimento.
   1. La camera di elettroporazione può essere facilmente fatta in casa da un girino scultura a forma di cavità in un piccolo Sylgard ® blocco di silicone, e l'inserimento di un filo d'argento di terra nella cavità in modo tale che sarà in contatto con il elettrotonici girino nella camera.
5. Girino lato la posizione supina per usare un pennello umido.
6. Abbassare la micropipetta fino a quando non è in contatto con la pelle, direttamente adiacente alla regione di interesse.
   1. Destinata alle regioni con i corpi cellulari densamente notevolmente aumentare le probabilità di successo elettroporazione.Noi di solito bersaglio il tectum girino ottica.
   2. Portare la micropipetta in un angolo di 30 a 45 gradi. Traiettorie più basse rendono più difficile perforare la pelle, mentre gli angoli più ripidi spesso ostacolano la propria vista.
7. Continua l'abbassamento della micropipetta inizialmente fossetta sulla pelle, e poi passare attraverso al tessuto sottostante.
   1. Cellule superficiali sono da preferire per imaging in vivo, e può essere bersaglio di modo che la punta della micropipetta si abbassa lentamente su fossette di pelle.
8. Si deve monitorare costantemente la resistenza micropipetta una volta inserito all'interno del tessuto. Se si utilizza un Axoporator 800A (Axon Instruments), resistenze di circa 10-40MΩ sono ottimali. La resistenza è un buon indicatore se il diametro della punta è appropriato per singola cellula elettroporazione.
   1. Resistenze micropipetta alta (> 100M) sono indicativi di consigli intasato o micropipette con punte che sono troppo strette.
   2. Resistenze micropipetta bassa (<10MΩ) sono indicativi di un diametro di punta che è troppo grande, spesso il risultato di una punta rotta.
   3. Se si utilizza uno stimolatore che non fornisce una misura diretta resistenza, la resistenza micropipetta può indirettamente misurati osservando l'ampiezza degli impulsi di tensione misurata dal oscilloscopio (discussa più avanti).
9. Applicare treno tensione.
   1. Per DNA plasmidico, treni di impulsi trovato per essere più efficaci consistono in negativo impulsi ad onda quadra di 1 ms di durata, consegnato a 300Hz con durata treno di impulsi di 500 ms.
      1. La tensione degli impulsi è determinato empiricamente in modo che l'ampiezza di impulsi misurata sull'oscilloscopio è compresa tra 0,75 e 1.5μA.
   2. Per i coloranti fluorescenti destrano, positivi impulsi ad onda quadra di durata 300μs sono consegnati ad una frequenza di 300Hz con durata treno di impulsi di 10ms.
      1. Come per il protocollo per il DNA, la tensione di impulso è determinato empiricamente in modo che l'ampiezza di impulsi misurata sull'oscilloscopio è compresa tra 0,75 e 1.5μA.
      2. Ulteriori modifiche ai parametri di stimolo può essere fatta sulla base osservando i risultati di elettroporazione in epifluorescenza.
         1. Se le cellule elettroporate apparire debole, i parametri di impulso dovrebbe essere gradualmente aumentata fino a quando le cellule appaiono più luminosi.
         2. D'altra parte, se gruppi di cellule sono etichettati, i parametri di impulso deve essere ridotta fino a quando singole cellule sono etichettati.
10. Ritrarre micropipetta, re-inserire in un sito diverso all'interno del tessuto, e applicare treno tensione.
    1. Per migliorare la resa, di solito electroporate diversi siti ogni emisfero del tectum girino ottica con una spaziatura sufficiente a garantire che le cellule etichettate non si sovrappongano.
11. Trasferire il girino elettroporate in un contenitore con la soluzione allevamento di Steinberg.
    1. Girini saranno rapidamente riprendersi dall'anestesia in pochi minuti.
12. La micropipetta stesso può essere utilizzato per numerosi girini. E 'importante osservare costantemente l'ampiezza degli impulsi osservata sull'oscilloscopio.
    1. Se l'ampiezza dell'impulso rimane bassa dopo aumentando significativamente l'intensità degli impulsi questo è probabilmente il risultato della punta è intasato, visto spesso quando electroporating molti girini in una sola seduta.
       1. Un metodo per rimuovere uno zoccolo minore suggerimento è quello di applicare un impulso positivo solo dopo aver inserito la micropipetta nel tessuto.
       2. Se lo zoccolo non può essere rimosso, o intasamento frequentemente ricorre, sostituire la micropipetta.
    2. Se l'ampiezza dell'impulso rimane molto grande dopo diminuendo in modo significativo i parametri degli impulsi, questo è un segno che la punta si è rotto e deve essere sostituito.

Screening per le cellule con successo elettroporate:

1. Dopo l'elettroporazione, i girini sono sottoposti a screening per le cellule etichettati utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale.
2. Nel caso di tinture fluorescenti, girini possono essere sottoposti a screening dopo appena 30 minuti dopo l'elettroporazione.
   1. Abbiamo trovato, comunque, che intervalli più lunghi sono associati a livelli più bassi di fluorescenza di fondo.
3. Per geneticamente codificato proteine ​​fluorescenti, lo screening si svolge generalmente almeno 12 ore dopo l'elettroporazione.
   1. Cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti continuerà ad avere più luminoso con il tempo, quindi le cellule dim possono essere nuovamente proiettati dopo un intervallo aggiuntivo di 12-24 ore.
4. Girini sono anestetizzati come sopra descritto, posto in una camera di Sylgard ® e coperti. Girini individuali vengono poi esaminati al epifluorescenza.
   1. Si noti che l'eccessiva esposizione alla luce epifluorescenza si tradurrà in fototossicità che può uccidere la cellula etichettati. Quindi, minimizzare la quantità di tempo che le cellule sono esposte alla luce fluorescente.
5. Ritorna girini di contenitore con la soluzione allevamento di Steinberg.

Discussion

Elettroporazione di singole cellule (SCE) è un potente strumento per determinare la funzione del gene e l'esecuzione di mirati manipolazione genetica. La trasparenza del girino albino e l'accessibilità del cervello fanno di questo sistema modello ideale per la visualizzazione di crescita neuronale e di eventi intracellulari all'interno di un organismo vivo. SCE permette la visualizzazione della crescita di un singolo neurone, e di eseguire manipolazioni cellulari autonoma all'interno di un cervello altrimenti inalterato. Mentre questo articolo video mostra la procedura per singola cellula elettroporazione in Xenopus laevis girini, questa tecnica è stata utilizzata in altri organismi, ed è stato utilizzato anche in fettine di ippocampo e colture di cellule dissociate.