Summary
إهاب المصنع هو غطاء شمعي الخارجي على النباتات التي لها دور أساسي في الحفاظ على المياه وإنما هو أيضا عائقا هاما أمام دخول الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح تحليل المسوخ بشرة النبات التي حددها الوراثة نهج الامام وعكس ذلك.
Abstract
إهاب المصنع هو غطاء شمعي الخارجي على النباتات التي لها دور أساسي في الحفاظ على المياه ، وإنما هو أيضا عائقا هاما أمام دخول الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض. وأدلى بشرة تتكون من البوليمر صعبة crosslinked يسمى "كوتين" وطبقة الشمع الواقية التي الاختام على سطح المصنع. طبقة شمعية للبشرة واضحة في كثير من النباتات ، يبدو وكأنه فيلم لامعة على أوراق اللبلاب أو الخارجي الذي يغطي الغبار على سطح العنب أو بفضل نبات الكرنب للضوء بلورات نثر موجودة في الشمع. لأن بشرة هو التكيف الضروري للنباتات في البيئة الأرضية ، فهم الجينات المسؤولة عن تكوين بشرة النبات لها تطبيقات في كل من الزراعة والغابات. اليوم ، وسوف نعرض تحليل المسوخ بشرة النبات التي حددها الوراثة نهج الامام وعكس ذلك.
Protocol
أولا شاشات المرئي وعكس النهج الوراثية لتحديد المسوخ البشرة.
وتسمى المسوخ في إهاب Arabidopsis thaliana نموذج مصنع "eceriferum" المسوخ ، الذي يعني "لا تحمل الشمع". أنها يمكن أن تكون في الشاشات البصرية ، وهذا هو ، فقط من خلال النظر في متحولة ، يمكنك أن ترى أن تنبع من الإزهار البرية من نوع النباتات بيضاء بينما المسوخ وينبع لامعة خضراء داكنة. واحدة من المسوخ التي كانت معزولة في هذا النوع من الشاشات المرئية وهذه واحدة ، ودعا eceriferum4 أو cer4.
طريقة أخرى لاكتشاف المسوخ جليدة للاهتمام هو مع نهج الوراثة العكسية : الجينات اختيار مرشح من الاهتمام والدراسة ثم خطوط النباتات مع الجينات التي تعطلت. هذه المسوخ وTDNA تعطيل الجينات في المصالح ، في هذه الحالة ، P450 السيتوكروم التي نسميها الآن MAH1.
يمكن لنتائج PCR (مثل واحد يظهر في شريط الفيديو) ، أن تؤكد أن الإدراج TDNA هو في الجينات في المصالح. عندما يتم استخدام اثنين من الجينات المحددة الاشعال لتضخيم البرية من نوع الحمض النووي ، ونحن نرى منتج ، ولكن إذا TDNA المقاطعات ، كما في هذا المسخ ، لا يوجد أي منتج هناك. على العكس ، وذلك باستخدام بادئات محددة لTDNA والجينات ، وينظر فقط منتج في متحولة. نحن نبحث عن خطوط متحولة متماثل ، حيث تتعطل كل من الأم والأب نسخ من الجين. إذا تعطلت نسخة واحدة من الجينات التي TDNA ونسخة أخرى لا يزال من النوع البري ، يتم خلط النتائج PCR.
II. استخدام اللوني للغاز لتحديد التركيب الكيميائي للشمع Cutlicle.
نقوم بتحليل التركيب الكيميائي للالشمع باستخدام الغاز اللوني. أولا ، يتم إزالة مركبات قابلة للذوبان الشمع من على سطح المصنع بواسطة غمس في الكلوروفورم.
ثم يتم حقن عينات الغاز في العمود اللوني ، حيث سيكون ساخنا أنهم وإرسالها عبر عن تيار من الغاز. مركبات مختلفة عصا أكثر أو أقل على الجدران من العمود الذي يفصل بين المركبات ، وخرجوا واحدا تلو الآخر في الطرف الآخر من العمود. بعد ذلك ، كما أن مركبات تمر عبر كاشف اللهب التأين ، ونحن نرى القمم. الوقت استبقاء كل ذروة هو سمة للمركبات مختلفة ، ومن مطياف الكتلة ، لدينا تعريف كل مكونات الشمع Arabidopsis. القمم الرئيسية التي موجودة في ألكان C29 ، C29 وكيتون والكحول C29 الثانوي. قمم طفيفة هي الكحولات الثانوية ، والأحماض الدهنية ، والألدهيدات واسترات. المنطقة تحت قمم ، نسبة إلى المعيار ، يخبرنا كم من كل مجمع موجود.
عندما تبحث في chromatograms الغاز من هذه المسوخ بشرة ، يمكن للمرء أن تلاحظ كيف cer4 يفتقر الى الكحولات الأولية واسترات ، في حين يفتقر mah1 الكحول الثانوي والكيتونات. يمكن لهذه الظواهر تخبرنا الكثير عن وظيفة الجين من الاهتمام في هذا المصنع. على سبيل المثال ، قال النمط الظاهري الذي عرفناه قبل الجين المتحور كانت في خط cer4 ، لنا ان هناك مشكلة في الفرع الرئيسي للكحول طريق السكروز. بعد أن درست هوية الجزيئي لهذا الجين في المعمل كونست ، اكتشفت أنه هو جزء من عائلة من الجينات reductases أسيل الدهنية ، والتي تناسبها بشكل جيد مع هذا النمط الظاهري الكيميائية.
III. باستخدام البرد SEM لتحديد بنية بلورات البشرة
عندما ندرس المسوخ إهاب Arabidopsis ، يمكننا أن نرى إذا كان لديهم الأخضر الداكن ، النمط الظاهري لامعة أو ظهور بيضاء من النوع البري على الجذع. نستخدم المجهر الإلكتروني الماسح للنظر في إهاب على سطح المصنع والتعرف على أساس النمط الظاهري البصرية. نستخدم البرد SEM ، تجميد النباتات وعرضها في درجة حرارة النتروجين السائل من أجل الحفاظ على بشرة سليمة لأن SEM يتطلب فراغا في العمل ودون ابقائها مجمدة ، وعينات وتجف والانهيار.
وهنا cer4 mah1 العينات ، جنبا إلى جنب مع عناصر التحكم من النوع البري ، هي تشريح والمجمدة على كعب SEM. عندما يتم نقل العينات إلى مرحلة الباردة من المجهر ، يمكنك أن ترى أن يتم تغطية سطح بشرة Arabidopsis الجذعية من النوع البري مع البلورات. هذا هو الضوء الذي هو نثر قبالة تلك البلورات التي تعطي الجذعية مظهره بيضاء. ومن هنا تنبع cer4 ، وتذكر أنها بدت لامعة؟ انها تفتقر الى بلورات على السطح.
فعلت تجارب الناس حيث عزل مركب من الشمع الخالص إهاب من النباتات وعندما recrystallize في المختبر ، على شكل بلورات الأشكال نفسها التي وجدت على النباتات. في Arabidopsis ، ونحن نعتقد أن تصنع بلورات تتكون من خليط من المركبات ويكون الوضع أكثر تعقيدا. على سبيل المثال ، التحليل الكيميائي يبين لنا أنه في cer4 ، إلا عنصرا ضئيلا من الكحولات الأولية والمشتقات استرات بهم في عداد المفقودين ، إلا أن بلورات على مولت R4 الجذعية. في حالة mah1 ، وأثر الطفرة في الانزيم الذي السيتوكروم P450 هو أن النباتات الطافرة نقص عنصرين رئيسيين من الكحول ، والشمع والكيتونات الثانوية ، إلا أن بلورات على النباتات mah1 شكل طبيعي.
لمعرفة المزيد عن المسوخ إهاب Arabidopsis يرجى الانتقال إلى الاستعراض السنوي للبيولوجيا النبات .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
