Summary
לציפורן המפעל היא הכיסוי החיצוני דונגי על צמחים שיש לו תפקיד עיקרי חיסכון במים אלא גם מחסום חשוב נגד כניסתם של מיקרואורגניזמים פתוגניים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניתוח לציפורן מוטנטים צמח שזוהה על ידי קדימה הפוכה גישות הגנטיקה.
Abstract
לציפורן המפעל היא הכיסוי החיצוני דונגי על צמחים שיש לו תפקיד עיקרי חיסכון במים, אך היא גם מחסום חשוב נגד כניסתם של מיקרואורגניזמים פתוגניים. לציפורן מורכב מפולימר crosslinked קשוח בשם "cutin" לבין שכבת שעווה מגן חותמות משטח המפעל. שכבת השעווה של לציפורן ברור על צמחים רבים, המופיעים כסרט נוצץ על עלה הקיסוס או כיסוי חיצוני מאובקים על פני השטח של ענבים או עלה כרוב בזכות אור גבישים פיזור נוכח השעווה. מכיוון לציפורן הוא עיבוד חיוני של צמחים לסביבה יבשתי, הבנה גנים המעורבים ביצירת לציפורן צמח יש יישומים בחקלאות וייעור. כיום, אנו נציג את ניתוח לציפורן מוטנטים צמח שזוהה על ידי קדימה הפוכה גישות הגנטיקה.
Protocol
אני מסכים חזותית גישות גנטיות הפוך כדי לזהות מוטציות לציפורן.
מוטנטים לציפורן של thaliana צמח המודל ארבידופסיס נקראים "eceriferum" מוטנטים, שפירושו "שעווה לא הנושא". הם יכולים להיות מסכי חזותית, כלומר, רק מלהסתכל מוטציה, ניתן לראות כי גבעול תפרחת של wild-type צמחים הוא לבנבן בעוד מוטציות יש נובעת מבריק בצבע ירוק כהה. אחד מוטנטים כי היה מבודד זה סוג של מסך החזותי הזה, שנקרא eceriferum4 או cer4.
דרך נוספת של גילוי מוטציות לציפורן מעניין עם גישה גנטיקה הפוכה: גנים מועמדים בבחירת הריבית ולאחר מכן קווי צמח ללמוד עם הגן משתבש. מוטנטים אלו TDNA לשבש את הגן של עניין, במקרה זה, ציטוכרום P450 שאנו מכנים כיום MAH1.
תוצאות ה-PCR (כמו זה המוצג בסרטון) יכול לאשר כי ההכנסה TDNA הוא הגן של עניין. כאשר שני גנים ספציפיים primers משמשים כדי להגביר wild-type-DNA, אנחנו רואים מוצר, אבל אם TDNA קוטע אותו, כמו זו מוטציה, אין מוצר שם. לעומת זאת, באמצעות פריימרים ספציפיים עבור TDNA ואת הגן, המוצר נתפס רק מוטציה. אנחנו מחפשים קווים מוטנטים הומוזיגוטים, שם הן עותקים אימהי ואבהי של הגן הם שיבשו. אם עותק אחד של הגן מופרת על ידי TDNA והעותק השני עדיין wild-type, התוצאות PCR מעורבבים.
השנייה. באמצעות גז כרומטוגרפיה לקבוע את ההרכב הכימי של שעווה Cutlicle.
אנו מנתחים את ההרכב הכימי של השעווה באמצעות גז כרומטוגרפיה. ראשית, תרכובות השעווה מסיסים יוסרו מן משטח המפעל על ידי טבילה אותו כלורופורם.
ואז, דגימות מוזרקים בעמודה גז כרומטוגרפיה, איפה הם יהיו מחוממת נשלח על ידי זרם של גז. תרכובות שונות מקל פחות או יותר על הקירות של הטור, הפרדת תרכובות, והם יצאו אחד אחרי השני בקצה השני של העמודה. ואז, כמו תרכובות לעבור מעל גלאי יינון להבה, אנו רואים את פסגות. זמן השמירה של שיא כל מאפיין עבור תרכובות שונות, החל ספקטרומטריית מסה, זיהינו כל המרכיבים של שעווה ארבידופסיס. הפסגות הגדולות כיום הן של alkane C29, C29 ו קטון האלכוהול C29 משנית. פסגות קטין הם כהלים משני, חומצות שומן, אלדהידים ו אסטרים. השטח מתחת הפסגות, יחסית סטנדרטי, מספר לנו עד כמה מתחם זה הוא ההווה.
כאשר מסתכלים chromatograms גז אלה מוטציות לציפורן, ניתן להבחין כיצד cer4 חסרה את כהלים ראשוניים אסטרים, בעוד mah1 חסר כהלים משני קטונים. פנוטיפים אלה יכולים לספר לנו הרבה על הפונקציה של הגן של עניין במפעל. לדוגמה, לפני שידענו מה היה מוטציה בגן בתור cer4, פנוטיפ אמרו לנו שיש בעיה בענף אלכוהול העיקרי של מסלול biosynthetic. אחרי זהות מולקולרית של הגן, כי נחקרה במעבדה Kunst, התגלה כי הוא חלק ממשפחה של גנים reductases acyl שומן, אשר עולה בקנה אחד עם פנוטיפ זה כימיים.
ג. שימוש cryo-SEM כדי לקבוע את המבנה של גבישים לציפורן
כאשר אנו בוחנים את מוטנטים לציפורן ארבידופסיס, אנו יכולים לראות אם יש להם פנוטיפ בצבע ירוק כהה, מבריק או את המראה wild-type לבנבן על גזע. אנו משתמשים מיקרוסקופ אלקטרונים סורק להסתכל לציפורן על פני השטח של הצמח ולזהות את הבסיס של פנוטיפ החזותי. אנו משתמשים cryo-SEM, הקפאת צמחים הצגתם בטמפרטורת חנקן נוזלי כדי לשמור לציפורן שלם כי SEM דורש ואקום לפעול מבלי לשמור אותם קפואים, דגימות היו להתייבש קריסה.
הנה cer4 ו mah1 דגימות, יחד עם wild-type שולטת, הם גזור קפואים על בדל SEM. כאשר דגימות מועברים הבמה בקור של המיקרוסקופ, ניתן לראות את פני השטח של לציפורן wild-type גזע ארבידופסיס מכוסה גבישי. זהו אור כי הוא מפזר את אלה גבישים שנותן את גזע מראה לבנבן שלה. הנה גזע cer4; לזכור שזה נראה מבריק? היא חסרה את גבישי על פני השטח.
אנשים עשו ניסויים שבהם הם לבודד תרכובת דונג טהור מן לציפורן של צמח וכשהם recrystallize זה במעבדה, הגבישים בצורת צורות כמו אלה שנמצאו על הצמחים. ב ארבידופסיס, אנו מאמינים כי את הגבישים עשויים מתערובת של תרכובות המצב מסובך יותר. לדוגמה, ניתוח כימי מראה לנו כי cer4, רק מרכיב קטן של כהלים ראשוניים אסטרים נגזרת שלהם חסרים, אך הגבישים על cer4 גזע נעלמו. במקרה של mah1, ההשפעה של המוטציה של אנזים ציטוכרום P450 היא כי צמחים מוטנטים חוסר שני המרכיבים העיקריים של, כהלים שעווה קטונים משנית, אך הגבישים על mah1 צמחים בצורה נורמלית.
כדי ללמוד עוד על מוטנטים לציפורן ארבידופסיס בבקשה ללכת סקירה שנתית לביולוגיה הצמח .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
