Biology

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

Published: March 21, 2008 doi: 10.3791/717

¹Psychiatry, Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, University of Massachusetts Medical School

Summary

최근까지, 인간의 두뇌에 대한 표현 연구 RNA 또는 단백질의 양을 정함으로 제한했다. 이 문서에 설명되어있는 염색질 immunoprecipitation 기술과 함께, 그것은 사후 두뇌에서 유전자 발현의 히스톤 methylation 및 기타 epigenetic 규제를지도로 가능합니다.

Abstract

이러한 정신 분열증, 양극성 질환과 자폐증과 같은 만성 질병 neuropsychiatric은 유전자 발현과 다른 분자 병리의 epigenetic 변경의 결과 수도 유전과 환경 요인의 조합에서 결과로 생각되고 있습니다. 전통적으로 그러나, 사후 두뇌의 표현 연구 mRNA 또는 단백질의 부량에 국한되어 있었다. 이러한 autolysis 시간과 조직 integrities에 variabilities으로 사후 뇌 연구에있어서 제한은 또한 높은 주문 염색질 구조의 연구에 영향을 가능성이 있습니다. 그러나, DNA를 포함한 게놈 DNA의 nucleosomal 조직 : 바인딩 핵심 히스톤은 - 대부분 다양한 뇌 은행에서 제공하는 대표적인 표본의 보존에 나타납니다. 따라서, 그것은 methylation 패턴과 사후 두뇌에 정의된 게놈 loci에서 핵심 histones의 다른 공유 결합 수정을 공부하는 것이 가능합니다. 여기, 우리는 냉동 (- 고정하지 않음) 인간의 두뇌 표본에 대한 간단한 기본 염색질 immunoprecipitation (NChIP) 프로토콜을 제시한다. 두뇌 homogenates의 micrococcal nuclease의 소화를 시작으로, NChIP는 qPCR 다음은 3 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 제시 방법은 정상과 병적인 인간의 두뇌에서 유전자 발현의 epigenetic 메커니즘을 명료하게하다하는 데 유용합니다.

Protocol

절차 :

1 ^{일 데이}

1. 버퍼 Douncing와 냉동 사후 회색 물질 조직 50-500 MG를 균질.

! 주의 - 인간의 조직은 엄격한 안전 조건 하에서 유의해서 다루어 져야한다. 이것은 BSL - 2 이상의 안전 기준에서 처리되어야합니다.

-80에서 이전 해부, 사후 뇌를 꺼내 ° C는 Douncing 버퍼의 배 뇌 용적에서 그들을 다운스, 및 2.0 ML의 microcentrifuge 관에서 개최. 샘플과 일치하고 제어 쌍을 동시에 처리됩니다.

2. Micrococcal Nuclease (MN) 소화

샘플로 Micrococcal nuclease의 5U/mL를 추가하고 얼음에 넣어 전에 위아래로 pipetting하여 솔루션 내에서 섞는다.
* 임계 단계 - MN도 4 행동할 수있는 능력을 가지고 이후 신속하게이 단계를 할 중요 ° C.
37 7 분 샘플을 품어 ° C.
7 분 부화 후, MNase 활동을 중지 10mM의 농도 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다.

3. Hypotonisation

플레이스 샘플 15 매 ML 튜브로. 0.2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 / 0.2M benzamidine과 0.1M의 phenylmethanesulphonylfluoride 1 / 1000 샘플 볼륨 (PMSF) 2000 샘플 볼륨의 10X 샘플 볼륨을 추가합니다. 후자의 두 화합물은 프로 테아제 억제제로 사용됩니다.
* 임계 단계 -이 단계 동안 얼음에 샘플을 유지하는 것이 중요합니다.
그것을 10 분마다 vortexing하면서 1 시간 동안 샘플을 품어.
시간 긴 인큐베이션의 끝에, 2천분의 1 3M DTT의 샘플 볼륨, 또 다른 프로 테아제 억제제를 추가합니다.
와동 샘플은 한 번 더 4 ° C. 10 분 3175 RCF에서 원심 분리기
* 선택 단계 - 단백질 G 아가로 오스와 Precleansing.
1. 뜨는 가지고 새로운 15 ML 팔콘 튜브에 넣어.
2. 단백질 G 아가로 오스 500 μL를 추가합니다.
3. 30 분 상온에서 회전.
4. 4 10 분 4,000 rpm으로 원심 분리기 ° C.
500 μL를 입력 제어 (단 게놈 DNA를 포함)로 사용되도록 뜨는 배포하고, 나머지는 각각의 샘플 1,600 μL 담긴 두개의 튜브로 나뉩니다 - 염색질 immunoprecipitation (칩) 샘플입니다.
입력 제어는 -80에서 배치됩니다 ° CO / N 더욱 사용까지.
칩 샘플을 위해 - 그 항체의 10XFSB 및 4μg의 1시 10분 볼륨, 소용돌이 샘플을 추가 4 ° C 야간에 그들을 돌린다.
! 주의 - 항체의 금액 및 희석 최적화가 필요할 수 있습니다.

2 ^차 주

! 주의! - nucleosomal DNA를 분리하는 데 사용됩니다 단백질 G 아가로 오스를 세척하여 2 ^차 일 시작합니다. 아가로 오스 비즈 매우 민감한 때문에, 그것은 아가로 오스 비즈가 포함된 솔루션을 pipetting 때마다 팁을의 머리를 잘라하는 것이 필요합니다.

1. DNA에 단백질 G 아가로 오스 비즈를 프로빙

2 ML의 microcentrifuge 관에 245 μL 단백질 G - 아가로 오스 (충분한 사 튜브에 대한) (루프)로 1.6 ML 1XFSB를 추가합니다.
이 두 ML 튜브 및 리필 1X FSB 각 최대 1.6 ML로 들어가서 해결책을 분리.
30 초에 대한 RT에서 회전 및 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기.
진공을 사용하여 표면에 뜨는를 제거합니다.
다시 한번 1.6 ML 1X FSB를 추가합니다. 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기 다음 30 초에 대한 샘플을 회전합니다.
다시 뜨는을 제거하고, 1.5 ML 1XFSB로 모두 튜브를 결합.
15 μL sonicated 연어 정자 DNA (10mg/mL)을 추가합니다.
! 주의 -이 단계는, 원칙적으로 구슬로 immunoprecipitate가 아닌 특정 바인딩을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이것은 또한 (인간)의 DNA 시퀀스의 일부에 대한 잘못된 반응을 초래할 수 있습니다.
30 분 RT에서 회전 후, 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기.
뜨는을 제거합니다. 1XFSB 200 μL를 추가합니다.
각각의 칩 샘플로 아가로 오스 비즈 90 μL를 추가합니다. 1 시간 4 ° C에서 회전합니다.
대조군 역할을하고 4 회전 ° C를 1 시간을 위해 남아있는 아가로 오스 비즈로 1XFSB의 1mL를 추가합니다.
시간 동안 배양 후, 30 초에 대한 0.1 RCF에서 샘플과 부정 컨트롤을 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.

2. 비즈 워싱

! 주의! - 워싱 버퍼는 ° C를 사용하기 전까지, 그리고 오래된 한 달 미만의 경우에만 사용됩니다 4 보관해야합니다.

비즈 각 세척 용액 1 ML을 추가하고 RT 3 분 돌린다.
30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기.
뜨는 사용하여 진공을 폐기하십시오.

* 각 세척 용액

- 낮은 소금 세척 버퍼

- 하이 소금 세척 버퍼 - 염화 리튬 솔루션 - 단 1 분 RT에서 회전!

- TE 버퍼 (10 MM 트리스, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 = 8)

3. 용리

* 임계 단계 - 그것이 사용할 수있는 날짜에 모든 실험에 대한 신선한 용출 버퍼를 확인합니다.

각 샘플에 신선한 용출 버퍼 250 μL를 추가합니다.
RT 15 분 회전, 다음 1 분 0.4 RCF에서 원심 분리기.
2.0 ML의 microcentrifuge 관 (루프)의 표면에 뜨는를 저장합니다.
몇 초 동안 손으로 각각의 샘플 및 와동에 용출 버퍼 250 μL를 추가합니다. 그런 다음, mulitvortexer에서 15 분 동안 와동 샘플.
사분 16 RCF rpm으로 원심 분리기와 같은 2.0 ML 튜브 (루프)에 뜨는 저장합니다.

4. 다이제스트 단백질

각각의 칩 샘플 10 μl 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 25 μl 0.8M 트리스 - HCL, pH를 6.5, 10 MG / ML Proteinase K (2백분의 1 샘플)를 추가합니다.
각각의 입력 제어, proteinase K의 소화 (샘플 버퍼의 1 / 10) 및 10mg/ml Proteinase K (샘플 버퍼의 1 / 200)에 대한 용해 버퍼를 추가합니다.
적어도 3 시간 52 ° C에서 입력 및 칩 샘플을 품어.

5. 클로로포름 / 페놀 추출

! 주의 - 실험 클로로포름 / 페놀 필요는 후드 아래에 수행되어야한다. 클로로포름 / 페놀 다룰 때 nitrile 장갑을 사용하십시오.

3 시간 부화 후, 각 시료에 500 μl 페놀 - 클로로포름을 추가합니다.
몇 초 동안 소용돌이 모든 샘플은 다음 5 분 13 RCF의 rpm으로 원심 분리기.
이 시점에서, 두 단계가 존재하고 우리는 최고 단계의 내용에 관심이 있습니다. 상단 위상을 가지고 2 ML의 microcentrifuge 관에 넣어.
100 % 에탄올의 1.375 ML과 함께 각각의 샘플에 3M의 아세트산 나트륨의 글리코겐과 50μL의 2μL의 혼합물을 추가합니다.
적극적으로 와동 모든 샘플. -80 ° C 하룻밤에 놓으십시오.

제 ^{3 주}

제거 샘플 양식 -80 ° C와 그들이 해동 위해 얼음에 그들을 놓으십시오.
4 10 분 15 RCF에서 원심 분리기 ° C.
조심스럽게 튜브 하단의 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 제거합니다.
각 샘플에 감기의 75 % 에탄올 1 ML 추가 후, 그들에게 4-6 번 반전.
4 5 분 18 RCF에서 원심 분리기 ° C.
한 번 더 뜨는 제거하고 알약 건조 공기 수 있습니다.
-80 50 4mm짜리 트리스 - HCL, pH8의 μL 및 저장소에 말린 알약을 디졸브 ° C 이상 사용까지.

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Discussion

프로토콜이 염색질 표시가 ^(히스톤) 아세틸화 및 인산화 ^하나를 포함하여 수정의 다른 유형에 비해 사후 유물이 적은 경향이있을 수 있기 때문에, 인간 두뇌의 히스톤 및 / 또는 DNA methylation 서명에 관심이 조사에 특히 유용합니다 여기에 설명된 ^2. 사후 두뇌는 모노 nucleosomal 준비 연구 의무이며 DNA가 최소한의 범위에서 일반적으로 대표 autolysis 간격 (죽음과 냉동 / 조직의 저장 사이의 시간)과 표본에서 크게 핵심 histones에 연결된 상태 몇 시간은 최대 1.5 일 ^1. 그러나, 모노 nucleosomal 준비, 특히 유전자 ³ 전사 시작 사이트를 둘러싼 시퀀스 주위 nucleosomal 위치와 밀도의 변화에 민감 수 있습니다. 따라서, 수정 독립적인 안티 히스톤 항체와 제어 실험이 포함되어야합니다. 또는 그것은 (ultracentrifugation 포함) 추가 정화 단계와 함께 micrococcal nuclease 다이제스트에 대한 짧은 배양 시간을 이용하여, 인간의 뇌 추출물의 쓰임새 nucleosomal 분수를 따로 떼어 볼 수 있습니다. 마지막으로, 사후 두뇌에 바인딩 게놈 - 광범위한 전사 인자에 대한 최근 연구는 단순히 sonication ^사를 통해 염색질을 빠졌어. 고장 및 / 또는 사망 후 이상 주문 염색질 구조의 인공 재구성가 통제하기 어려울 가능성이 confounds 있기 때문에 특히, 사전 sonication이나 효소 기반의 소화에 고정하여 염색질의 준비, 사후 연구의 관점에서 이상되지 않을 수 있습니다. 따라서 사후 뇌에 칩 assays는 nucleosomal 핵심 histones과 단단히 게놈 DNA에 연결된 다른 단백질 분자를 포함하여 제한된 수의에 대한 유용 가능성이 있습니다. 도 고려이 경고와 함께,이 프레 젠 테이션에 제시된 접근법은 정상 및 병적인 인간의 두뇌에의 연결 및 glial 기능을 적용 염색질 결합 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공할 가능성이 있습니다.

우리는 성공적으로 주로 유전자 qPCR ^{1, 5, 6} 유전자를 사용하여 특정 발기인에서 히스톤 methylation과 히스톤 occupancies의 측정이 기술을 사용해 왔습니다. 마찬가지로 이전에 명시된 인간의 사후 두뇌는 DNA가 크게 핵심 histones에 연결된 남아 있기 때문에 모노 nucleosomal 준비 연구에 복종할 의무가있는 것으로 보인다. 일반적으로, 인간의 아이 또는 성인 대뇌 피질의 75 MG (회색 물질)로 시작하는 경우는 50 μl의 총 볼륨의 μl / NG 입력 및 10-15를 위해 제시 프로토콜 위에 20-30의 수율을 사용하여 기대할 수 칩 50 μl의 총 볼륨의 μl / NG, 적어도 변경 특정 안티 히스톤 항체를 사용하는 경우. 입력 비율 소위 칩은 측정의 단위입니다. 반응 특이성은 곡선 분석, 겔 전기 및 시퀀싱을 용해에 의해 모니터링됩니다. 또한, 부정적인 제어 (I)는 특정 항체를 부족 또는 (ii) 포함하는 (비 특정) 면역 글로불린은 칩 및 입력 샘플을 병행 qPCR에 의해 처리되어야하며 특정 제품에 결과가 없습니다. 젤에서 실행하면 연어 정자가 차단 요원으로 사용하는 경우, 컨트롤 샘플 얼룩이 발생할 수있다는 점에 유의하십시오.

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Acknowledgments

이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (5R01MH071476)에서 부여에 의해 지원되었다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO₃, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO₃, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.