Summary
До недавнего времени выражение исследования человеческого мозга были ограничены количественного РНК или белка. С хроматин иммунопреципитации методы описаны в этой статье, можно будет сопоставить гистонов метилирование и других эпигенетических регуляторов экспрессии генов в посмертных мозг.
Abstract
Хронический психоневрологических заболеваний, таких как шизофрения, биполярное заболевание и аутизмом, как полагают, является результатом сочетания генетических и экологических факторов, которые могут привести к эпигенетических изменений экспрессии генов и других молекулярных патологии. Традиционно, однако, выражение исследований в посмертных мозга были приурочены к количественной оценке мРНК или белка. Ограничения встречаются в посмертных исследований мозга, такие как изменчивость в аутолиза времени и ткани целостностей также возможных последствий любого исследования высшей структуры хроматина порядке. Тем не менее, нуклеосомной организации геномной ДНК, включая ДНК: основные гистонов обязательным - как представляется, в значительной степени сохранились в репрезентативных выборок, предоставляемых различными банками мозга. Таким образом, можно изучать метилирования и другие ковалентные модификации гистонов ядро в определенные геномных локусов в посмертных мозг. Здесь мы приведем упрощенную родной хроматин иммунопреципитации (NChIP) протокол для замороженных (никогда не фиксированной) образцы человеческого мозга. Начиная с микрококковой нуклеазы пищеварения мозга гомогенатов NChIP следуют КПЦР может быть завершена в течение трех дней. Методология, представленная здесь, должно быть полезным для выяснения эпигенетические механизмы экспрессии генов в нормальных и больных человеческого мозга.
Protocol
Порядок действий:
1-й день
1. Однородный 50-500 мг замороженных посмертного серое вещество ткани с Douncing буфера.
! ВНИМАНИЕ -! Правам ткани должны быть обработаны с осторожностью, под строгим условиям безопасности. Обращайтесь в BSL-2 или более высоким стандартам безопасности.
- Возьмите ранее рассеченные, посмертные мозг от -80 ° C, Dounce их в 5 раз объем мозга Douncing буфера, и место в трубку 2,0 микроцентрифужных мл. Согласованные образца и контроля пар обрабатываются одновременно.
2. Микрококковой нуклеазой (MN) Пищеварение
- Добавить 5U/mL из микрококковой нуклеазы к образцу и смешивать в растворе с помощью пипетки вверх и вниз перед размещением на льду.
* Важный шаг - Важно сделать этот шаг, быстро, поскольку MN имеет способность действовать на еще 4 ° C. - Инкубируйте образцы в течение 7 минут при температуре 37 ° C.
- После 7 минут инкубации, добавляют 0,5 М ЭДТА до концентрации 10 мМ, чтобы остановить MNase деятельности.
3. Hypotonisation
- Место образцов в 15 мл трубки сокола. Добавить 10X образца объемом 0,2 ЭДТА, 1 / 2000 объем пробы 0,2 М benzamidine и 1 / 1000 образцов объемом phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 М (PMSF). Последние два соединения используются в качестве ингибиторов протеазы.
* Важный шаг - Важно сохранить образцы на льду во время всех этих шагов. - Инкубируйте образца на 1 час, в то время вортексе его каждые 10 минут.
- В конце часовой инкубации, добавить 1 / 2000 объема образца 3М DTT, еще один ингибитор протеазы.
- Vortex образец еще раз и центрифуге при 3175 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
* Факультативный шаг - Precleansing с Protein G агарозы.- Возьмите супернатант и поставить в новый 15 мл трубки сокола.
- Добавить 500 мкл белка G агарозы.
- Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
- Распространение супернатант, так что 500 мкл используются в качестве входного контроля (содержащие только геномной ДНК), а остальное разделить на две пробирки, содержащие 1600 мкл образца каждого, - которые для иммунопреципитации хроматина (чип) образцов.
- Входной контроль находится при температуре -80 ° CO / N до последующего использования.
- Для ChIP образцов - добавить 1:10 Объем 10XFSB и 4μg антител, то вихрь образцов и поворачивать их при температуре 4 ° С в течение ночи.
! ВНИМАНИЕ -! Количество и разведение антител может потребовать оптимизации.
2-го дня
! ВНИМАНИЕ! - Начало 2-й день, если мыться Protein G агарозы, который будет использоваться для изоляции нуклеосомной ДНК. С агарозном бисер очень чувствительны, надо отрезать глав советов, когда любой пипетки раствор, содержащий агарозном бисером.
1. Зондирование Protein G агарозном Бусины с ДНК
- Добавить 1,6 мл 1XFSB до 245 мкл белка G-агарозы (достаточно для 4 труб) в 2 мл микроцентрифужных трубы (петли).
- Отдельное решение на две 2 мл труб и пополнить каждая до 1,6 мл с 1X ФСБ.
- Поворот при комнатной температуре в течение 30 сек и центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
- Удалить супернатант использованием вакуума.
- Добавить 1,6 мл 1X ФСБ еще раз. Поворот образцов в течение 30 секунд, а затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
- Удалить супернатант еще раз, и объединить обе трубы с 1,5 мл 1XFSB.
- Добавьте 15 мкл ультразвуком ДНК спермы лосося (10mg/mL).
! ВНИМАНИЕ -! Этот шаг должен, в принципе, уменьшить неспецифическое связывание иммунопреципитации с бисером. Однако это также может привести к ложным положительным результатам для некоторых (человека) последовательностей ДНК. - Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
- Удалить супернатант. Добавить 200 мкл 1XFSB.
- Добавить 90 мкл из бисера агарозы в каждый чип образца. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа.
- Добавить 1 мл 1XFSB в оставшиеся бисером агарозы в качестве отрицательного контроля и вращаются на 4 ° С в течение 1 часа.
- После часовой инкубации, центрифуги образцов и отрицательного контроля на уровне 0,1 RCF на 30 сек. Удалите супернатант.
2. Стиральная бисер
! ВНИМАНИЕ! - Стиральная буферы должны храниться при температуре 4 ° С до использования, и будут использоваться только в том случае меньше, чем месяц назад.
- Добавить 1 мл каждого мытья решение бисером и вращаться в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга на 0,1 RCF на 30 сек.
- Удалите надосадочную использованием вакуума.
* Каждый моющего раствора
- Низкий буфер мытье соли
- Высокая буфера стиральной соли
- Раствор Хлорид лития - только вращаться при комнатной температуре в течение 1 минуты!- TE буфера (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА рН = 8)
3. Элюирование
* Важный шаг - Сделать свежие буфера элюции для каждого эксперимента на день она будет использоваться.
- Добавьте 250 мкл свежеприготовленного элюции буфера каждого образца.
- Поворот на 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги в 0,4 RCF в течение 1 мин.
- Сохранить супернатант в микроцентрифужных 2,0 мл трубки (Loop).
- Добавьте 250 мкл буфера для элюции каждого образца и вихревые вручную в течение нескольких секунд. Затем вихрь образцов в течение 15 минут на mulitvortexer.
- Центрифуга на 16 оборотов в минуту RCF в течение 4 минут и сохранить супернатант в том же 2,0 мл трубки (Loop).
4. Дайджест белка
- Добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 25 мкл 0.8M Tris-HCl, рН 6,5, 10 мг / мл протеиназы К (1 / 200 проба), чтобы каждый чип образца.
- Для каждого входного контроля, добавить буфер для лизиса протеиназы К пищеварения (1 / 10 образца буфера) и 10mg/ml протеиназы К (1 / 200 образца буфера).
- Инкубируйте Входные и ChIP образцов в 52 ° С в течение 3 часов.
5. Фенол / хлороформ добычи
! ВНИМАНИЕ -! Эксперимент требует фенол / хлороформ должна быть выполнена под капотом. Используйте нитриловые перчатки при работе с фенол / хлороформ.
- После 3-часовой инкубации, мы добавляем 500 мкл фенол-хлороформ для каждого образца.
- Vortex всех образцов в течение нескольких секунд, затем центрифуге при 13 RCF оборотов в минуту в течение 5 мин.
- На данный момент, две фазы будут присутствовать, и мы заинтересованы в содержании верхней фазе. Выньте верхнюю фазу и положить его в 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавить смесь 2μL гликогена и 50 мкл 3М ацетата натрия к каждому образцу наряду с 1,375 мл 100% этанола.
- Vortex всех образцов энергично. Поместите их в -80 ° С в течение ночи.
3-го дня
- Удалить образцы формы -80 ° C и поместите их на лед для них оттепели.
- Центрифуга на 15 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул в нижней части трубы.
- Добавьте 1 мл холодного 75% этанола на каждого образца, затем инвертировать их 4-6 раз.
- Центрифуга на 18 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант еще раз и позволяют гранулы высохнуть на воздухе.
- Растворить сухой гранул в 50 мкл 4 мм Трис-HCl, PH8 и хранить при температуре -80 ° C до последующего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол изложенных здесь особенно полезен для следователей интересует гистонов и / или метилирования ДНК подписей человеческого мозга, потому что эти хроматина маркировка может быть менее склонными к посмертной артефакты по сравнению с другими типами модификаций, в том числе (гистонов) ацетилирования и фосфорилирования 1, 2. Посмертных мозг поддается изучению моно-нуклеосомной препаратов; ДНК остается в значительной степени придает основной гистонов, по крайней мере в образцах с представителем интервалы аутолиза (время между смертью и замораживания / хранение ткани) обычно находится в диапазоне от нескольких часов до 1,5 суток 1. Тем не менее, моно-нуклеосомной подготовки могут быть чувствительны к изменениям нуклеосомной позиционирования и плотности, особенно вокруг последовательности окружающих старта транскрипции генов сайтов 3. Таким образом, контрольные эксперименты с модификацией-независимые анти-гистонов антитела должны быть включены. Кроме того, это может быть возможным, чтобы изолировать поли-нуклеосомной фракций из экстракта мозга человека, используя более короткие сроки инкубации в течение микрококковой нуклеазы переварить в сочетании с дополнительной стадии очистки (в том числе ультрацентрифугирования). Наконец, последние исследования генома фактора транскрипции обязательными в посмертных мозг просто стриженой хроматина с помощью ультразвука 4. Примечательно, что подготовка хроматина фиксацией до пищеварения ультразвуком или на основе ферментов не может быть идеальным с точки зрения посмертных исследований, так как срыв и / или искусственных реконфигурации более высокого порядка, структуры хроматина после смерти являются потенциальными смешивает трудно контролировать. Таким образом, ChIP пробы на посмертных мозг, вероятно, будут полезны для ограниченного числа молекул, в том числе нуклеосомной гистонов ядра и других белков плотно прикреплена к геномной ДНК. Даже с этой оговоркой учитывать, подходы, изложенные в данной презентации могут обеспечить романа понимание хроматина связанных механизмы, регулирующие нейронов и глиальных функции в нормальных и больных человеческого мозга.
Мы использовали этот метод успешно в первую очередь для измерения гистонов метилирование гистонов и заселенности на конкретных промоутеров использованием гена гена КПЦР 1, 5, 6. Как было сказано выше человеческого мозга посмертных, кажется, поддается изучению моно-нуклеосомной подготовка потому ДНК остается в значительной степени придает основной гистонов. Как правило, когда, начиная с 75 мг человеческого ребенка или взрослого коры головного мозга (серого вещества) можно ожидать, используя протокол приведенные выше-выход 20-30 нг / мкл в общем объеме 50 мкл для входа и 10-15 нг / мкл в общем объеме 50 мкл для чипа, по крайней мере, когда конкретные модификации гистонов анти-антитела используются. Так называемый чип для входного соотношение единицы измерения. Специфика реакции контролируется кривой плавления анализа, гель-электрофореза и секвенирования. Кроме того, отрицательный контроль (я) не хватает специфических антител или (II), содержащий (неспецифический) иммуноглобулина должны быть обработаны КПЦР параллельно с чипом и входных образцов и не должно привести к конкретным продуктом. Помните, что при спермы лосося используется как блокирующий агент, контрольных образцов может привести к мазке при запуске на гель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института психического здоровья (5R01MH071476).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tris-HCl | EMD Millipore | 9310 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur, EMD Millipore | 5980 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | |
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur, EMD Millipore | 4055 | |
Sodium Chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-06 | |
SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | |
Triton X-100 | Fluka | 93426 | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-25G | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650-100G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S7277-250G | |
Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma-Aldrich | S-2889 | |
Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma-Aldrich | N3755-200UN | |
Benzamidine | Fluka | 12072 | |
Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
3M DTT | Fluka | 43815 | |
Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate, Millipore | 16-266 | |
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene, Agilent Technologies | 201190 | |
Proteinase K from Engyodontium album | Sigma-Aldrich | P2308 | |
Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur, EMD Millipore | 6810 | |
Glycogen, From Mussels | Sigma-Aldrich | G1767-1VL | |
Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Solutions:
|
|||
|
References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
- Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.