Summary
हाल ही में जब तक, मानव मस्तिष्क पर अभिव्यक्ति के अध्ययन शाही सेना या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए सीमित थे. Chromatin immunoprecipitation इस पत्र में वर्णित तकनीकों के साथ, यह संभव हो सकता है और शवपरीक्षा मस्तिष्क में जीन की अभिव्यक्ति के histone मेथिलिकरण अन्य epigenetic नियामकों नक्शा है.
Abstract
एक प्रकार का पागलपन, द्विध्रुवी रोग और autism के रूप में लगातार neuropsychiatric बीमारियों आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि जीन अभिव्यक्ति और अन्य आणविक विकृति के epigenetic परिवर्तन में परिणाम हो सकता है की एक संयोजन से परिणाम के लिए लगा रहे हैं. परंपरागत रूप से, तथापि, शवपरीक्षा मस्तिष्क में अभिव्यक्ति अध्ययन mRNA या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए ही सीमित थे. autolysis समय और ऊतक integrities में variabilities जैसे शवपरीक्षा मस्तिष्क अनुसंधान में आई सीमाओं को भी उच्च आदेश chromatin संरचनाओं के किसी भी अध्ययन के प्रभाव की संभावना है. हालांकि, जीनोमिक डीएनए के nucleosomal डीएनए सहित संगठन: histone कोर - बाध्यकारी प्रतिनिधि मस्तिष्क के विभिन्न बैंकों द्वारा उपलब्ध कराई गई नमूनों में काफी हद तक संरक्षित प्रतीत होता है. इसलिए, यह संभव है मेथिलिकरण पैटर्न और शवपरीक्षा मस्तिष्क में परिभाषित जीनोमिक loci में कोर histones के अन्य सहसंयोजक संशोधनों का अध्ययन. यहाँ, हम एक सरलीकृत जमी (निर्धारित कभी नहीं) मानव मस्तिष्क नमूनों के लिए देशी chromatin immunoprecipitation प्रोटोकॉल (NChIP) उपस्थित थे. Micrococcal मस्तिष्क homogenates की nuclease पाचन के साथ शुरू, NChIP qPCR द्वारा पीछा तीन दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति सामान्य और रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति के epigenetic तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
प्रक्रिया:
1 सेंट दिवस
1. बफर Douncing साथ जमे हुए मामला पोस्टमार्टम ग्रे ऊतक के 50-500 मिलीग्राम homogenize.
! चेतावनी - मानव ऊतक सख्त सुरक्षा शर्तों के तहत देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. यह BSL-2 या उच्च सुरक्षा मानकों को नियंत्रित किया जाना चाहिए.
- -80 से पहले dissected, मस्तिष्क पोस्टमार्टम लो ° सी, उन्हें Douncing बफर के 5X मस्तिष्क की मात्रा में dounce, और 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह. नमूना मिलान और नियंत्रण जोड़े एक साथ संसाधित कर रहे हैं.
2. Micrococcal Nuclease पाचन (MN)
- नमूना Micrococcal nuclease के 5U/mL जोड़ें और मिश्रण बर्फ पर रखने से पहले ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान के भीतर.
* महत्वपूर्ण कदम - यह महत्वपूर्ण है इस कदम जल्दी से एम.एन. 4 भी कार्य करने की क्षमता है डिग्री सेल्सियस - 7 मिनट के लिए 37 नमूने सेते डिग्री सेल्सियस
- 7 मिनट ऊष्मायन के बाद, 10mm के एक एकाग्रता के लिए 0.5m EDTA जोड़ने के लिए MNase गतिविधि को रोकने.
3. Hypotonisation
- एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब में प्लेस के नमूने. 10X 0.2mm EDTA, 1 / 2000 0.2M benzamidine और 1 / 1000 0.1M phenylmethanesulphonylfluoride का नमूना मात्रा (PMSF) नमूना मात्रा के नमूना मात्रा में जोड़ें. बाद के दो यौगिकों protease inhibitors के रूप में उपयोग किया जाता है.
* महत्वपूर्ण कदम - यह महत्वपूर्ण है बर्फ पर इन सभी चरणों के दौरान नमूने रखने है. - 1 घंटे के लिए नमूना सेते हैं, जबकि यह हर 10 मिनट vortexing.
- घंटे लंबी ऊष्मायन के अंत में, 1 / 2000 3M डीटीटी का नमूना मात्रा, अभी तक एक protease अवरोध करनेवाला जोड़ें.
- भंवर नमूना एक बार और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3175 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र
* वैकल्पिक कदम - प्रोटीन जी agarose साथ Precleansing.- सतह पर तैरनेवाला लो और नए 15 एमएल बाज़ ट्यूब में डाल दिया.
- प्रोटीन जी agarose के 500 μL जोड़ें.
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाएँ.
- 4 में 10 मिनट के लिए 4000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला वितरित इतना है कि 500 μL इनपुट नियंत्रण (केवल जीनोमिक डीएनए युक्त) के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, और बाकी दो प्रत्येक नमूना के 1600 μL युक्त ट्यूब में विभाजित है - जो chromatin immunoprecipitation नमूने (चिप) के लिए कर रहे हैं.
- इनपुट नियंत्रण -80 पर रखा गया है जब तक आगे उपयोग CO / N °.
- चिप नमूने - 10XFSB और एंटीबॉडी के 4μg 1:10 मात्रा, तो भंवर नमूने जोड़ने और उन्हें बारी बारी से 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात.
! चेतावनी - राशि और एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है .
2 एन डी दिवस
! चेतावनी! - प्रोटीन जी agarose कि nucleosomal डीएनए अलग किया जाएगा धोने द्वारा 2 एन डी दिन शुरू करो. चूंकि agarose मोती बहुत संवेदनशील होते हैं, के लिए रवाना सुझावों की सिर काट जब भी किसी भी agarose मोती युक्त समाधान pipetting आवश्यक है.
1. डीएनए के लिए प्रोटीन जी agarose मोती जांच
- 245 μL प्रोटीन 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में (4 ट्यूबों के लिए पर्याप्त) जी agarose (पाश) में 1.6 एमएल 1XFSB जोड़ें.
- अलग दो 2 एमएल ट्यूब और 1X FSB के साथ प्रत्येक 1.6 एमएल ऊपर फिर से भरना में समाधान.
- 30 सेकंड के लिए आरटी पर घुमाएँ और 30 सेकंड के लिए 0.1 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला एक निर्वात का उपयोग कर.
- 1.6 एमएल 1X FSB एक बार फिर से जोड़ें. 30 सेकंड के लिए नमूने घुमाएँ और फिर 30 सेकंड के लिए 0.1 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला एक बार फिर से निकालें, और 1.5 एमएल 1XFSB दोनों ट्यूबों के साथ गठबंधन.
- 15 μL sonicated सामन शुक्राणु डीएनए (10mg/mL) जोड़ें.
! चेतावनी - यह कदम, सिद्धांत रूप में, गैर विशिष्ट immunoprecipitate के मनकों के लिए बाध्य कम करना चाहिए. हालांकि, यह भी (मानव) डीएनए दृश्यों के लिए कुछ झूठी सकारात्मक के लिए नेतृत्व सकता है. - 30 मिनट के लिए आरटी पर घुमाएँ, फिर 30 सेकंड के लिए 0.1 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें. 1XFSB के 200 μL जोड़ें.
- प्रत्येक चिप नमूना में agarose मोती के 90 μL जोड़ें. 1 घंटे के लिए 4 ° C पर घुमाएँ.
- शेष agarose मोती में 1XFSB के 1ml जोड़ें करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए और 4 में बारी बारी से ° 1 घंटे के लिए सी.
- घंटे लंबी ऊष्मायन के बाद, 0.1 आरसीएफ में 30 सेकंड के लिए नमूने और नकारात्मक नियंत्रण अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
2. मोती धुलाई
! चेतावनी! - धुलाई बफ़र्स डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक 4 में रखा जाना चाहिए, और करने के लिए इस्तेमाल किया जा केवल अगर एक महीने से भी कम कर रहे हैं.
- मोतियों के लिए प्रत्येक धोने के समाधान के 1 एमएल जोड़ें और आरटी पर 3 मिनट के लिए बारी बारी से.
- 30 सेकंड के लिए 0.1 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र.
- निर्वात का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
* प्रत्येक धोने समाधान
कम नमक धोने बफर
उच्च नमक धोने बफर लिथियम क्लोराइड समाधान - केवल 1 मिनट के लिए आरटी पर बारी बारी से!
- ते बफर (10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA = पीएच 8)
3. Elution
* महत्वपूर्ण कदम - यह करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है पर हर दिन प्रयोग लिए ताजा Elution बफर बनाओ .
- प्रत्येक नमूने के हौसले से तैयार elution बफर के 250 μL जोड़ें.
- घुमाएँ आरटी पर 15 मिनट के लिए, तो 1 मिनट के लिए 0.4 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला एक 2.0 एमएल microcentrifuge ट्यूब (लूप) में सहेजें.
- प्रत्येक नमूने और कुछ सेकंड के लिए हाथ से भंवर elution बफर के 250 μL जोड़ें. फिर, एक mulitvortexer पर 15 मिनट के लिए भंवर नमूने.
- 4 मिनट के लिए 16 आरसीएफ rpm पर अपकेंद्रित्र और एक ही 2.0 एमएल ट्यूब (लूप) में सतह पर तैरनेवाला बचाने.
4. डाइजेस्ट प्रोटीन
- प्रत्येक चिप नमूना 10 μl 0.5m EDTA, 25 μl 0.8M Tris - एचसीएल, 6.5 पीएच, 10 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर (नमूना 1 / 200) जोड़ें.
- प्रत्येक इनपुट को नियंत्रित करने के लिए, proteinase कश्मीर (1 / 10) नमूना बफर के पाचन और 10mg/ml proteinase कश्मीर (/ 1 नमूना बफर के 200) के लिए lysis बफर जोड़ें.
- कम से कम 3 घंटे के लिए 52 ° सी में इनपुट और चिप नमूने सेते हैं.
5. Phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण
! चेतावनी - प्रयोग की आवश्यकता होती है / phenol क्लोरोफॉर्म हुड के तहत किया जाना चाहिए. जब / phenol क्लोरोफॉर्म से निपटने nitrile दस्ताने का उपयोग करें.
- 3 घंटे ऊष्मायन के बाद, हम प्रत्येक नमूना के लिए 500 μl फिनोल - क्लोरोफॉर्म जोड़ने के.
- भंवर कई सेकंड के लिए सभी नमूनों, तो 5 मिनट के लिए 13 आरसीएफ rpm पर अपकेंद्रित्र.
- इस बिंदु पर, दो चरणों मौजूद हो सकता है और हम शीर्ष चरण की सामग्री में रुचि रखते हैं. शीर्ष चरण ले लो और यह एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में डाल दिया.
- प्रत्येक नमूने के लिए 1.375 एमएल के साथ 100% इथेनॉल के साथ और 3M सोडियम एसीटेट के Glycogen 50μL के 2μL का एक मिश्रण जोड़ें.
- भंवर सभी सख्ती नमूने. -80 डिग्री सेल्सियस रात भर में उन्हें रखें.
3 rd दिन
- नमूने निकालें -80 फार्म ° सी और उन्हें पिघलना करने के लिए बर्फ पर उन्हें जगह है.
- 4 में 10 मिनट के लिए 15 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- ध्यान से ट्यूब के नीचे गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
- प्रत्येक नमूने के लिए ठंड 75% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें, तो उन्हें 4-6 बार पलटना.
- 4 में 5 मिनट के लिए 18 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला अधिक एक बार निकालें और छर्रों शुष्क हवा करने के लिए अनुमति देते हैं.
- 4mm Tris - एचसीएल, PH8 के 50 μL और दुकान में -80 पर सूखे छर्रों भंग डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग.
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Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित मानव मस्तिष्क के histone और / या डीएनए मेथिलिकरण हस्ताक्षर में रुचि जांचकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, क्योंकि इन chromatin चिह्नों कम शवपरीक्षा कलाकृतियों के लिए प्रवण के रूप में संशोधनों के (histone एसिटिलीकरण) और एक phosphorylation सहित अन्य प्रकार की तुलना में किया जा सकता है, 2. शवपरीक्षा मस्तिष्क मोनो nucleosomal तैयारी के अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है, डीएनए बड़े पैमाने पर कोर histones से जुड़ी प्रतिनिधि autolysis (मौत और ठंड / ऊतक के भंडारण के बीच का समय) में आम तौर पर रेंज के अंतराल के साथ नमूनों में कम से कम रहता है, कई घंटे तक 1.5 एक दिन. हालांकि, मोनो - nucleosomal तैयारी nucleosomal स्थिति और घनत्व में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील प्रतिलेखन 3 जीनों के शुरू साइटों के आसपास के दृश्यों के आसपास विशेष रूप से , हो सकता है. इसलिए, संशोधन स्वतंत्र विरोधी histone एंटीबॉडी के साथ नियंत्रण प्रयोगों को शामिल किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, यह मानव मस्तिष्क के अर्क से पाली nucleosomal भिन्न अलग micrococcal nuclease पचाने में के लिए कम ऊष्मायन बार अतिरिक्त शोधन कदम के साथ संयोजन के रूप में (incl. ultracentrifugation) का उपयोग संभव हो सकता है. अंत में, जीनोम चौड़ा प्रतिलेखन कारक पर हाल के एक अध्ययन शवपरीक्षा मस्तिष्क में बाध्यकारी बस 4 sonication के माध्यम से chromatin sheared. विशेष रूप से, chromatin की sonication या एंजाइम आधारित पाचन पहले निर्धारण द्वारा तैयारी शवपरीक्षा अध्ययन की दृष्टि से आदर्श नहीं हो सकता है, क्योंकि टूटने और / या मृत्यु के बाद उच्च आदेश chromatin संरचनाओं के कृत्रिम पुनर्विन्यासन संभावित करने के लिए नियंत्रण के लिए मुश्किल घालमेल कर दिया हैं. इसलिए, शवपरीक्षा मस्तिष्क पर चिप assays nucleosomal कोर histones और अन्य कसकर जीनोमिक डीएनए से जुड़ी प्रोटीन सहित अणुओं की एक सीमित संख्या के लिए उपयोगी होने की संभावना हैं. यहां तक कि इस खाते में ले लिया चेतावनी के साथ, इस प्रस्तुति में उल्लिखित दृष्टिकोण chromatin जुड़े सामान्य और रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क में neuronal और glial कार्यों गवर्निंग तंत्र में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की संभावना है.
हम सफलतापूर्वक मुख्य रूप से और विशिष्ट जीन जीन qPCR 1, 5, 6 का उपयोग कर प्रमोटरों पर histone मेथिलिकरण histone occupancies को मापने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. जैसा कि पहले कहा मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क मोनो nucleosomal तैयारी के अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी हो सकता है क्योंकि डीएनए बड़े पैमाने पर कोर histones से जुड़ी रहती है. आमतौर पर, जब मानव बच्चे या वयस्क प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के 75 मिलीग्राम (ग्रे बात) के साथ शुरू एक इनपुट और 10-15 एनजी / 50 μl की कुल मात्रा में μl प्रस्तुत प्रोटोकॉल के ऊपर एक 20-30 की उपज का उपयोग करने की उम्मीद कर सकते हैं एनजी / चिप के लिए 50 μl की कुल मात्रा में μl, कम से कम जब संशोधन विशिष्ट विरोधी histone एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं. तथाकथित इनपुट अनुपात करने के लिए चिप माप की इकाई है. प्रतिक्रिया की विशिष्टता वक्र विश्लेषण, जेल वैद्युतकणसंचलन, और अनुक्रमण पिघलने से नजर रखी है. इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण (i) विशिष्ट एंटीबॉडी कमी या (ii) युक्त immunoglobulin (गैर विशिष्ट) चिप और इनपुट के नमूने के लिए समानांतर में qPCR द्वारा संसाधित किया जाना चाहिए और विशिष्ट उत्पाद में परिणाम नहीं चाहिए. ध्यान रखें कि जब सामन शुक्राणु एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है, नियंत्रण के नमूने एक धब्बा में परिणाम जब एक जेल पर चलने.
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Acknowledgments
इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (5R01MH071476) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | EMD Millipore | 9310 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur, EMD Millipore | 5980 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | |
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur, EMD Millipore | 4055 | |
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-06 | |
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-25G | |
| Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650-100G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S7277-250G | |
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma-Aldrich | S-2889 | |
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma-Aldrich | N3755-200UN | |
| Benzamidine | Fluka | 12072 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| 3M DTT | Fluka | 43815 | |
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate, Millipore | 16-266 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene, Agilent Technologies | 201190 | |
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur, EMD Millipore | 6810 | |
| Glycogen, From Mussels | Sigma-Aldrich | G1767-1VL | |
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Solutions:
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References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
- Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.
