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Biology

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Published: March 21, 2008 doi: 10.3791/717
Automatic Translation
1, 1
1Psychiatry, Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, University of Massachusetts Medical School

Summary

Bis vor kurzem waren Ausdruck Studien über menschliche Gehirn zu Quantifizierung von RNA oder Proteine ​​beschränkt. Mit dem Chromatin-Immunopräzipitation Techniken in diesem Papier beschrieben wurde, wird es möglich sein, Histon-Methylierung und andere epigenetische Regulatoren der Genexpression in postmortem Gehirn abzubilden.

Abstract

Chronische neuropsychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie, bipolare Erkrankung und Autismus werden gedacht, um aus einer Kombination von genetischen und umweltbedingten Faktoren, die in epigenetischen Veränderungen der Genexpression und andere molekulare Pathologie Ergebnis führen könnte. Traditionell wurden jedoch Ausdruck Studien in post mortem Gehirn Quantifizierung von mRNA oder Protein beschränkt. Die Einschränkungen in postmortem Hirnforschung wie Variabilitäten in Autolyse Zeit und Gewebe Ganzheiten angetroffen werden wahrscheinlich auch keine Studien höherer Ordnung Chromatin-Strukturen auswirken. Doch die nukleosomalen Organisation der genomischen DNA mit DNA: Kern Histon-Bindung - offenbar weitgehend in repräsentativen Stichproben von verschiedenen Hirn-Banken erhalten. Daher ist es möglich, die Methylierungsmuster und andere kovalente Modifikationen der Core-Histone in definierten genomischen Loci in post mortem Gehirn zu studieren. Hier präsentieren wir eine vereinfachte nativen Chromatin-Immunopräzipitation (NChIP)-Protokoll für gefrorene (nie fest) menschliche Gehirn Proben. Beginnend mit Mikrokokken-Nuclease Verdauung von Hirnhomogenaten, gefolgt NChIP von qPCR können innerhalb von drei Tagen abgeschlossen sein. Die Methodik hier vorgestellten sollte nützlich sein, um epigenetische Mechanismen der Gen-Expression in normalen und erkrankten menschlichen Gehirn aufzuklären.

Protocol

Vorgehensweise:

1. Tag

1. Homogenisieren 50-500 mg des gefrorenen post-mortem grauen Gewebe mit Douncing Buffer.

! ACHTUNG - Menschliches Gewebe muss mit Sorgfalt unter strengen Sicherheitsbedingungen gehandhabt werden. Es sollte bei BSL-2 oder höhere Sicherheitsstandards verarbeitet werden.

  1. Nehmen Sie vorher seziert, post-mortem Gehirn von -80 ° C, Dounce sie in 5X Hirnvolumen von Douncing Buffer, und in 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Matched Probe und Kontrolle Paare werden gleichzeitig verarbeitet.

2. Mikrokokken-Nuclease (MN) Verdauung

  1. Add 5U/mL der Mikrokokken-Nuclease zur Probe und mischen in der Lösung von Auf-und Abpipettieren, bevor Sie auf dem Eis.
    * Kritischer Schritt - Es ist wichtig, diesen Schritt zu schnell tun, da MN hat die Fähigkeit, bei noch 4 wirken ° C.
  2. Inkubieren Proben für 7 Minuten bei 37 ° C.
  3. Nach dem 7-minütigen Inkubation, fügen 0,5 M EDTA in einer Konzentration von 10 mM der MNase Aktivität zu stoppen.

3. Hypotonisation

  1. Ort Proben in einem 15 ml Falcon-Röhrchen. Add 10X das Probenvolumen von 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 Probenvolumen von 0,2 M Benzamidin und 1 / 1000 Probenvolumen von 0,1 phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Die beiden letztgenannten Verbindungen werden als Proteaseinhibitoren verwendet.
    * Kritischer Schritt - Es ist wichtig, die Proben auf Eis halten während all dieser Schritte.
  2. Inkubieren Sie die Probe für 1 Stunde, während Vortexen es alle 10 Minuten.
  3. Am Ende der einstündigen Inkubation, fügen 1 / 2000 Probenvolumen von 3M DTT, noch eine weitere Protease-Hemmer.
  4. Vortex Probe noch einmal und in 3175 RCF für 10 Minuten zentrifugieren bei 4 ° C.
    * Optionaler Schritt - Precleansing mit Protein G Agarose.
    1. Nehmen Sie den Überstand und setzen in neuen 15 ml Falcon-Röhrchen.
    2. Add 500 ul von Protein G Agarose.
    3. Drehen Sie bei Raumtemperatur für 30 min.
    4. Zentrifuge bei 4000 rpm für 10 min bei 4 ° C.
  5. Verteilen Überstand, so dass 500 ul als Input-Steuerung (mit nur genomische DNA) verwendet werden, und der Rest ist in zwei Röhrchen mit 1600 ul Probe jeweils aufgeteilt - die für Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Proben.
  6. Die Input-Steuerung ist bei -80 º CO / N bis zur weiteren Verwendung.
  7. Um den Chip-Proben - add 1.10 Volumen von 10XFSB und 4μg von Antikörpern, dann Wirbel der Proben und drehen Sie sie bei 4 ° C über Nacht.
    ! ACHTUNG - Menge und Verdünnung der Antikörper kann verlangen Optimierung.

2. Tag

! VORSICHT! - Beginn 2. Tag durch Waschen des Protein G Agarose, die zur nukleosomalen DNA zu isolieren wird. Da Agaroseperlen sehr empfindlich sind, ist es notwendig, den Kopf abgehauen, der Spitzen, wenn Pipettieren keine Lösung Agaroseperlen.

1. Untersuchung von Protein G Agarose Beads zur DNA

  1. Fügen Sie 1,6 ml 1XFSB bis 245 ul Protein G-Agarose (reicht für 4 Röhren) in ein 2 ml Reaktionsgefäß (loop).
  2. Trennen Sie die Lösung in zwei 2 ml-Röhrchen und füllen jeweils bis zu 1,6 ml mit 1X FSB.
  3. Drehen Sie bei RT für 30 sec und Zentrifuge bei 0,1 RCF für 30 sek.
  4. Entfernen Sie den Überstand mit einem Staubsauger.
  5. Fügen Sie 1,6 ml 1X FSB wieder. Drehen Sie die Proben für 30 sec und dann Zentrifuge bei 0,1 RCF für 30 sek.
  6. Entfernen Sie den Überstand erneut, und kombinieren Sie beide Röhren mit 1,5 mL 1XFSB.
  7. Add 15 ul beschallt Lachssperma-DNA (10mg/ml).
    ! ACHTUNG - Dieser Schritt sollte im Prinzip zu reduzieren unspezifische Bindung der Immunopräzipitat zu den Perlen. Doch dies könnte auch zu Fehlalarmen für einige der (menschlichen) DNA-Sequenzen führen.
  8. Drehen Sie bei RT für 30 min, dann bei 0,1 RCF Zentrifuge für 30 sek.
  9. Entfernen Sie den Überstand. Add 200 ul 1XFSB.
  10. Add 90 &mgr; l Agaroseperlen in jedem ChIP Probe. Drehen bei 4 ° C für 1 Stunde.
  11. 1ml von 1XFSB in übrigen Agaroseperlen als negative Kontrolle dienen und drehen bei 4 ° C für 1 Stunde.
  12. Nach der einstündigen Inkubation Zentrifuge der Proben und Negativ-Kontrolle bei 0,1 RCF für 30 sek. Überstand verwerfen.

2. Waschen der Beads

! VORSICHT! - Waschpuffer ist bei 4 ° C aufbewahrt werden, bis zu verwenden, und werden nur verwendet, wenn sich weniger als einen Monat alt sein.

  1. 1 ml der jeweiligen Waschlösung, die Perlen und drehen für 3 min bei RT.
  2. Zentrifuge bei 0,1 RCF für 30 sek.
  3. Überstand mittels Vakuum.

* Jede Waschlösung

- Low Salz Waschpuffer

- Hohe Salz Waschpuffer - Lithium-Chlorid-Lösung - nur bei RT drehen für 1 Minute!

- TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elution

* Kritischer Schritt - Machen Sie frische Elutionspuffer für jedes Experiment am Tag es ist, verwendet werden.

  1. Add 250 ul frisch zubereiteten Elutionspuffer zu jeder Probe.
  2. Drehen Sie für 15 min bei RT, dann mit 0,4 RCF für 1 min zentrifugiert.
  3. Speichern Sie die Überstand in ein 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen (Loop).
  4. Add 250 ul Elutionspuffer zu jeder Probe und Wirbel von Hand für ein paar Sekunden. Dann Wirbel Proben für 15 Minuten auf einem mulitvortexer.
  5. Zentrifuge bei 16 RCF rpm für 4 Minuten und speichern in gleichen 2,0 ml Röhrchen (Loop) Überstand.

4. Digest Protein

  1. Fügen Sie 10 ul 0,5 M EDTA, 25 ul 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml Proteinase K (1 / 200 Proben) für jede ChIP Probe.
  2. Jedem Eingang kontrollieren, fügen Lysepuffer für die Proteinase K-Verdau (10.01 Probenpuffer) und 10mg/ml Proteinase K (1 / 200 Probenpuffer).
  3. Inkubieren Eingangs-und Chip-Proben in 52 ° C für mindestens 3 Stunden.

5. Phenol / Chloroform-Extraktion

! ACHTUNG - Experiment erfordert Phenol / Chloroform sollte unter der Haube vorgenommen werden. Verwenden Sie Handschuhe aus Nitril beim Umgang mit Phenol / Chloroform.

  1. Nach dem 3 Stunden Inkubation, fügen wir die 500 ul Phenol-Chloroform zu jeder Probe.
  2. Vortex alle Proben für einige Sekunden, dann bei 13 RCF rpm für 5 min zentrifugieren.
  3. An dieser Stelle werden zwei Phasen vorhanden sein, und wir sind daran interessiert, den Inhalt von der oberen Phase. Nehmen Sie die obere Phase und steckte es in ein 2 ml Reaktionsgefäß.
  4. Fügen Sie eine Mischung aus 2μL von Glykogen und 50 ul 3M Natriumacetat zu jeder Probe mit 1,375 ml 100% Ethanol.
  5. Vortex alle Proben kräftig. Legen Sie sie in -80 ° C über Nacht.

3. Tag

  1. Entfernen Proben bilden -80 ° C und legen sie auf Eis für sie zu tauen.
  2. Zentrifuge bei 15 RCF für 10 Minuten bei 4 ° C.
  3. Sorgfältig Überstand zu entfernen, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens.
  4. 1 ml kaltem 75% Ethanol zu jeder Probe, dann invertieren sie 4-6 mal.
  5. Zentrifuge bei 18 RCF für 5 min bei 4 ° C.
  6. Überstand entfernen noch einmal und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.
  7. Lösen getrockneten Pellets in 50 ul von 4mm Tris-HCl, pH 8 und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

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Discussion

Das Protokoll hier skizzierte ist besonders nützlich für die Ermittler in Histon und / oder DNA-Methylierungs-Signaturen des menschlichen Gehirns interessiert, weil diese Chromatin Markierungen möglicherweise weniger anfällig für postmortale Artefakte als andere Arten von Änderungen, einschließlich (Histon) Acetylierung und Phosphorylierung 1 verglichen, 2. Die Obduktion des Gehirns ist offen für das Studium der Mono-nukleosomalen Präparate, die DNA bleibt weitgehend auf die Core-Histone angebracht, zumindest in Proben mit repräsentativen Autolyse Abständen (die Zeit zwischen Tod und das Einfrieren / Speichern des Gewebes) typischerweise im Bereich von mehrere Stunden bis zu 1,5 Tage 1. Allerdings könnte mono-nukleosomalen Vorbereitungen empfindlich auf Veränderungen in nukleosomalen Positionierung und Dichte, vor allem rund um Sequenzen umliegenden Ablese-Startpunkten von Genen 3. Daher sollten Kontrollversuche mit Modifikation-unabhängigen Anti-Histon-Antikörper enthalten sein. Alternativ kann es möglich sein, Poly-nukleosomalen Fraktionen aus menschlichem Gehirn-Extrakte zu isolieren, mit kürzeren Inkubationszeiten für die Mikrokokken-Nuclease verdaut in Verbindung mit zusätzlichen Reinigungsstufen (inkl. Ultrazentrifugation). Schließlich wird eine aktuelle Studie über genomweite Transkriptionsfaktorbindungsstellen in post mortem Gehirn einfach Chromatin via Ultraschall 4 geschert. Bemerkenswert ist, kann die Herstellung von Chromatin durch Fixierung vor Beschallung oder Enzym-basierten Verdauung nicht ideal aus der Sicht der Autopsie-Studien, da Abbau-und / oder künstliche Umgestaltung der höheren Ordnung Chromatin-Strukturen nach dem Tod Potential verwechselt schwer zu kontrollieren sind. Daher sind ChIP-Assays auf postmortem Gehirn wahrscheinlich für eine begrenzte Anzahl von Molekülen, einschließlich nukleosomalen Core-Histone und andere Proteine ​​eng mit der genomischen DNA angehängt nützlich. Selbst mit dieser Einschränkung zu berücksichtigen, sind die Ansätze in dieser Präsentation beschrieben wahrscheinlich neue Einblicke in Chromatin-assoziierten Mechanismen, die neuronalen und glialen Funktionen im gesunden und kranken menschlichen Gehirns geben.

Wir haben diese Technik erfolgreich in erster Linie für die Messung von Histon-Methylierung und Histon-Belegungen an Promotoren mit Gen für Gen qPCR 1, 5, 6 verwendet. Wie bereits erwähnt das menschliche Gehirn post mortem zu sein scheint offen für die Untersuchung von mono-nukleosomalen Vorbereitungen, weil die DNA bleibt weitgehend auf die Core-Histone befestigt. Normalerweise, wenn beginnend mit 75 mg des menschlichen Kind oder Erwachsener Großhirnrinde (graue Substanz) kann man erwarten, unter Verwendung des Protokolls vorgestellt oben eine Ausbeute von 20-30 ng / ul in einem Gesamtvolumen von 50 ul für den Eingang und 10-15 ng / ul in einem Gesamtvolumen von 50 ul für ChIP, zumindest wenn Modifikation spezifischer Anti-Histon-Antikörper verwendet werden. Der so genannte Chip auf Input-Verhältnis ist die Maßeinheit. Die Spezifität der Reaktion wird durch Schmelzkurvenanalyse, Gelelektrophorese und Sequenzierung überprüft. Darüber hinaus negative Kontrollen (i) ohne die spezifische Antikörper oder (ii) die (unspezifische) Immunglobulin sollte durch qPCR in das parallel zum Chip und Input-Proben verarbeitet werden und sollte nicht in bestimmten Produkts führen. Seien Sie sich bewusst, dass, wenn Lachssperma als Blockierungsmittel verwendet wird, Kontrollproben kann ein Abstrich Ergebnis, wenn auf einem Gel laufen.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Mental Health (5R01MH071476) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

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References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

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Neuroscience Ausgabe 13 Postmortem Gehirn Nucleosome Histon Methylierung Epigenetische Chromatin Human Brain
A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue
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Matevossian, A., Akbarian, S. A… More

Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

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