Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Summary

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Abstract

מחלות נוירו כרונית כגון סכיזופרניה, מחלה דו קוטבית אוטיזם נחשבים כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים לגרום לשינויים epigenetic של ביטוי גנים לפתולוגיה מולקולרית אחרים. באופן מסורתי, עם זאת, מחקרים ביטוי במוח שלאחר המוות הוגבלו כימות mRNA או חלבון. המגבלות נתקל במחקר שלאחר המוות המוח כגון variabilities בזמן autolysis ו integrities רקמות עשויים גם להשפיע מחקרים של מבנים גבוהים על מנת הכרומטין. עם זאת, הארגון nucleosomal של הדנ"א הגנומי כולל ה-DNA: ליבה היסטון מחייב - נראה להישמר בעיקר מדגמים מייצגים הניתנים על ידי בנקים שונים במוח. לפיכך, ניתן ללמוד את דפוס מתילציה ושינויים קוולנטיים אחרים של ההיסטונים הליבה לוקוסים הגנומי מוגדרים במוח שלאחר המוות. כאן, אנו מציגים פשוטה יליד הכרומטין immunoprecipitation (NChIP) פרוטוקול קפוא (לא קבועה) דגימות מוח אנושי. החל העיכול nuclease micrococcal homogenates של המוח, בעקבות NChIP ידי qPCR ניתן להשלים בתוך שלושה ימים. המתודולוגיה המוצגת כאן צריך להיות שימושי להבהיר מנגנוני epigenetic של ביטוי גנים במוח אנושיים בריאים וחולים.

Protocol

נוהל:

1 ^st יום

1. Homogenize 50-500 מ"ג של רקמת שלאחר המוות אפור קפוא משנה עם Douncing חוצץ.

! זהירות - רקמה אנושית יש לטפל בזהירות תחת תנאי בטיחות מחמירים. זה צריך להיות מטופל בבית BSL-2 ומעלה תקני הבטיחות.

1. קח גזור בעבר, שלאחר המוות של המוח -80 ° C, dounce להם נפח מוח 5X של הצפת Douncing, ומכניסים צינור microcentrifuge 2.0 מ"ל. בהתאמה מדגם זוגות לשלוט מעובדים בו זמנית.

2. Micrococcal nuclease (MN) עיכול

1. הוסף 5U/mL של Micrococcal nuclease המדגם ומערבבים תוך פתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה לפני הצבת על הקרח.
   * שלב קריטי - חשוב לעשות את הצעד הזה מהר מאז MN יש את היכולת לפעול על אף 4 ° C.
2. דגירה דגימות 7 דקות 37 ° C.
3. לאחר דגירה של 7 דקות, מוסיפים EDTA 0.5m ריכוז של 10mm להפסיק את פעילות MNase.

3. Hypotonisation

1. המקום דגימות לתוך שפופרת 15 מ"ל בז. הוספת נפח 10X המדגם של 0.2mM EDTA, 1 / 2000 נפח דגימה של benzamidine 0.2M ונפח מדגם 1 / 1000 של phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). האחרון שתי תרכובות משמשים מעכבי פרוטאז.
   * שלב קריטי - חשוב לשמור את דגימות קרח במהלך כל השלבים הללו.
2. דגירה מדגם שעה 1, בעוד vortexing זה כל 10 דקות.
3. בסוף הדגירה הארוכה שעה, להוסיף נפח דגימה 1 / 2000 של 3M DTT, עוד מעכב פרוטאז.
4. מדגם וורטקס פעם נוספת צנטריפוגות ב RCF 3175 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   * שלב אופציונלי - Precleansing עם חלבון G agarose.
   1. קח supernatant ולשים צינור חדש בז 15 מ"ל.
   2. הוספת 500 μL של חלבון G agarose.
   3. סובב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   4. צנטריפוגה בסל"ד 4000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
5. הפץ supernatant כך 500 μL משמשים לשלוט קלט (המכילים DNA הגנומי בלבד), והשאר מחולק לשני צינורות המכיל 1600 μL של המדגם כל - שהם עבור הכרומטין immunoprecipitation (שבב) דגימות.
6. בקרת קלט ממוקם ב -80 ° CO / N עד לשימוש נוסף.
7. כדי דגימות שבב - להוסיף נפח של 1:10 10XFSB ו 4μg של נוגדנים, ואז המערבולת דגימות ולסובב אותם 4 ° C למשך הלילה.
   ! זהירות - כמות דילול של הנוגדן עשוי לדרוש אופטימיזציה.

2 ^nd יום

! זהירות! - בגין יום 2 ^nd על ידי שטיפת חלבון G agarose אשר ישמשו לבודד DNA nucleosomal. מאז חרוזים agarose רגישים מאוד, יש צורך לנתק את ראשי טיפים בכל פעם pipetting כל תמיסה המכילה חרוזים agarose.

1. גשוש חלבון G חרוזים agarose ל-DNA

1. הוסף 1.6 מ"ל 1XFSB עד 245 μL חלבון ה-G-agarose (מספיק ל 4 צינורות) בצינור microcentrifuge 2 מ"ל (לולאה).
2. הפרד את הפתרון לשתי 2 צינורות מ"ל ולמלא כל אחד עד 1.6 מ"ל עם 1X FSB.
3. סיבוב ב RT במשך 30 שניות ו צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות.
4. הסר את supernatant באמצעות ואקום.
5. הוסף 1.6 מ"ל 1X FSB שוב. סובב את הדגימות למשך 30 שניות ואז צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות.
6. הסר את supernatant שוב, לשלב את שתי מבחנות עם 1.5 מ"ל 1XFSB.
7. הוסף 15 זרע μL sonicated סלמון DNA (10mg/mL).
   ! זהירות - שלב זה אמור, באופן עקרוני, להפחית את הלא ספציפית מחייב immunoprecipitate אל חרוזים. עם זאת, זה גם יכול להוביל חיוביות שגויות עבור חלק (אדם) רצפי DNA.
8. סיבוב ב RT למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות.
9. הסר את supernatant. הוספת 200 μL של 1XFSB.
10. הוסף 90 μL של חרוזים agarose לתוך מדגם כל שבב. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
11. הוסף 1mL של 1XFSB לתוך הנותרים חרוזים agarose לשמש מלאה שלילי לסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
12. לאחר דגירה ארוכה שעה, בצנטריפוגה דגימות ובקרה שלילי RCF 0.1 למשך 30 שניות. בטל supernatant.

2. כביסה חרוזים

! זהירות! - מאגרים כביסה יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, יש להשתמש בהם רק אם הם פחות מחודש הישן.

1. הוסף 1 מ"ל של כל פתרון כביסה על חרוזים לסובב דקות 3 ב RT.
2. צנטריפוגה ב RCF 0.1 למשך 30 שניות.
3. בטל ואקום באמצעות supernatant.

* פתרון כל כביסה

- מלח נמוכה כביסה חיץ

- מלח גבוהים כביסה חיץ - ליתיום כלוריד פתרון - רק לסובב ב RT דקה 1!

- TE חיץ (10 mM טריס, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elution

* שלב קריטי - הפוך הצפת elution טריים עבור כל ניסוי ביום זה היא לשמש.

1. הוספת 250 μL של חיץ טרי elution מוכן מדגם זה.
2. סובב במשך 15 דקות ב RT, אז צנטריפוגות ב RCF 0.4 דקות 1.
3. שמור את supernatant בצינור 2.0 microcentrifuge מ"ל (Loop).
4. הוספת 250 μL של חיץ elution לטעום כל מערבולת ביד במשך כמה שניות. ואז, דגימות מערבולת במשך 15 דקות על mulitvortexer.
5. צנטריפוגה ב 16 RCF סל"ד במשך 4 דקות ולשמור אותו supernatant ב 2.0 מ"ל צינור (Loop).

4. תקציר חלבון

1. הוסף 10 μl EDTA 0.5m, 25 μl 0.8M טריס-HCl, pH 6.5, 10 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K (1 / 200 לדוגמה) לדגום כל שבב.
2. כדי לשלוט בכל קלט, להוסיף למאגר תמוגה לעיכול K proteinase (1 / 10 של חיץ מדגם) ו 10mg/ml proteinase K (1 / 200 חוצץ לדוגמה).
3. דגירה קלט דגימות שבב 52 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות.

5. פנול / כלורופורם מיצוי

! זהירות - ניסוי המחייב פנול / כלורופורם צריכה להתבצע מתחת למכסה המנוע. השתמש בכפפות בעת טיפול nitrile פנול / כלורופורם.

1. לאחר דגירה של 3 שעות, נוסיף את 500 μl פנול, כלורופורם מדגם זה.
2. כל וורטקס דגימות במשך כמה שניות, ואז צנטריפוגות בסל"ד RCF 13 דקות 5.
3. בנקודה זו, בשני שלבים יהיו נוכחים ואנחנו מעוניינים בתוכן של השלב העליון. קח את השלב העליון והכניס אותו לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
4. מוסיפים תערובת של 2μL של גליקוגן 50μL של נתרן אצטט 3M מדגם זה יחד עם 1.375 מ"ל של אתנול 100%.
5. כל וורטקס דגימות במרץ. מניחים אותן -80 ° C במשך הלילה.

3 ^rd יום

1. הסר דגימות טופס -80 ° C ומניחים אותם על הקרח להם להפשיר.
2. צנטריפוגה ב RCF 15 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. מוציאים בזהירות supernatant מבלי להפריע גלולה בחלק התחתון של הצינור.
4. הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% קרים מדגם זה, ואז להפוך אותם 4-6 פעמים.
5. צנטריפוגה RCF ב 18 דקות 5 ב 4 ° C.
6. הסר supernatant שוב ולאפשר כדורי לייבוש באוויר.
7. ממיסים כדורי מיובשים μL 50 של 4 מ"מ טריס-HCl, pH8 ולאחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי במיוחד עבור החוקרים מעוניינים חתימות מתילציה היסטון ו / או ה-DNA של המוח האנושי, כי אלה סימנים הכרומטין ניתן נוטה פחות חפצים הנתיחה שלאחר המוות לעומת סוגים אחרים של שינויים, כולל acetylation (היסטון) ו זירחון ^{1, 2.} המוח הנתיחה ניתנת ללימוד מונו nucleosomal ההכנות, ה-DNA נשאר מחובר, במידה רבה, את ההיסטונים הליבה, לפחות עם דגימות במרווחים autolysis נציג (הזמן בין מוות הקפאה / אחסון של הרקמה) בדרך כלל בטווח של כמה שעות עד 1.5 ימים ^1. עם זאת, מונו nucleosomal ההכנות שעלול להיות רגיש לשינויים מיצוב צפיפויות nucleosomal, במיוחד סביב סביב רצפים להתחיל שעתוק של גנים באתרים ^3. לכן, ניסויים שליטה עם שינוי עצמאית אנטי היסטון נוגדנים צריך להיות כלול. לחלופין, ייתכן שניתן לבודד מרובה nucleosomal שברים של תמציות המוח האנושי, באמצעות פעמים הדגירה קצר יותר עבור nuclease micrococcal לעכל יחד עם הצעדים הנוספים טיהור (כולל ultracentrifugation). לבסוף, מחקר שנערך לאחרונה ב-גנום רחב גורם שעתוק מחייבים במוח שלאחר המוות טעון פשוט הכרומטין דרך sonication ^4. יש לציין, הכנה של הכרומטין על ידי קיבוע לפני העיכול sonication או אנזים מבוססי לא יכול להיות אידיאלי מנקודת המבט של מחקרים שלאחר המוות, כי התמוטטות ו / או שינוי תצורה מלאכותית גבוהה הכרומטין מבנים כדי שלאחר המוות הם מקעקעת את הפוטנציאל קשה לשלוט על. לפיכך, מבחני השבב על המוח המוות צפויים להיות שימושי עבור מספר מוגבל של מולקולות, כולל ליבת ההיסטונים nucleosomal וחלבונים אחרים מחוברים באופן הדוק ל-DNA הגנומי. אפילו עם אזהרה זו נלקחת בחשבון, הגישות שתוארו במצגת זו עשויים לספק תובנות לתוך הרומן הכרומטין הקשורים המנגנונים השולטים פונקציות עצב גליה במוח האנושי בריאים וחולים.

השתמשנו בטכניקה זו בהצלחה בעיקר למדידת מתילציה של היסטון ו occupancies היסטון על היזמים ספציפיים באמצעות הגן על ידי הגן qPCR ^{1, 5, 6.} כפי שצוין קודם לכן את המוח האנושי המוות נראה מקובל במחקר של מונו nucleosomal ההכנות כי ה-DNA נשאר מחובר, במידה רבה, את ההיסטונים הליבה. בדרך כלל, כאשר מתחילים עם 75 מ"ג של ילד או אדם מבוגר קליפת המוח (חומר אפור) ניתן לצפות באמצעות פרוטוקול שהוצגו לעיל, תשואה של 20-30 ng / μl בהיקף כולל של 50 μl עבור קלט ו 10-15 ng / μl בהיקף כולל של 50 μl עבור שבב, לפחות כאשר שינוי מסוים אנטי היסטון נוגדנים משמשים. שבב שנקרא יחס קלט היא יחידת מידה. הספציפיות של התגובה מנוטר על ידי המסת ניתוח עקומת, ג'ל אלקטרופורזה, וסדר. בנוסף, שולטת שלילי (i) חסר נוגדנים ספציפיים או (ii) מכיל אימונוגלובולינים (לא ספציפי) צריך להיות מעובד על ידי qPCR במקביל השבב דוגמאות קלט לא צריך להביא מוצר ספציפי. שים לב שכאשר זרע סלמון משמש כסוכן חסימה, דגימות שליטה עלול לגרום משטח כאשר לרוץ על ג'ל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.