Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Summary

Jusqu'à récemment, les études d'expression sur le cerveau humain ont été limités à la quantification de l'ARN ou les protéines. Avec les techniques d'immunoprécipitation de chromatine décrites dans ce document, il sera possible de cartographier la méthylation des histones et d'autres régulateurs épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau post-mortem.

Abstract

Chronique maladies neuropsychiatriques comme la schizophrénie, la maladie bipolaire et l'autisme sont considérés comme le résultat d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux qui pourraient résulter de modifications épigénétiques de l'expression génique et d'autres pathologie moléculaire. Traditionnellement, cependant, les études d'expression dans le cerveau post-mortem ont été confinés à la quantification de l'ARNm ou de protéines. Les limites rencontrées dans la recherche du cerveau post-mortem tels que des variabilités dans le temps et l'autolyse des tissus intégrités sont également susceptibles d'affecter toutes les études des structures supérieures chromatine ordre. Cependant, l'organisation de l'ADN génomique nucléosomiques y compris l'ADN: core histones contraignant - semble largement préservées dans des échantillons représentatifs fournis par les banques du cerveau différentes. Par conséquent, il est possible d'étudier le modèle de méthylation et d'autres modifications covalentes des histones fondamentales définies au loci génomiques dans le cerveau post-mortem. Ici, nous présentons une version simplifiée natif immunoprécipitation de la chromatine (NChIP Protocol) pour les échantillons congelés du cerveau (jamais fixe) humaine. En commençant par la nucléase micrococcal digestion des homogénats de cerveaux, NChIP suivie par qPCR peut être complété dans les trois jours. La méthodologie présentée ici devrait être utile pour élucider les mécanismes épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau humain normal et pathologique.

Protocol

Procédure:

1 ^er jour

1. Homogénéiser 50-500 mg de tissu congelé matières post-mortem gris avec Douncing Tampon.

! ATTENTION - Les tissus humains doivent être manipulés avec soin dans des conditions de sécurité strictes. Il doit être manipulé à des normes de sécurité BSL-2 ou supérieur.

1. Prenez précédemment disséqué, post-mortem du cerveau de -80 ° C, les Dounce de volume du cerveau de tampon 5X Douncing, et les placer dans le tube 2,0 ml microtubes. Matched échantillon et le contrôle des paires sont traitées simultanément.

2. Micrococcal nucléase (MN) Digestion

1. Ajouter 5U/mL des Micrococcal nucléase à l'échantillon et mélanger dans la solution par aspiration et refoulement avant de placer sur la glace.
   * ÉTAPE CRITIQUE - Il est important de faire cette étape rapidement car MN a la capacité d'agir, même à 4 ° C.
2. Incuber les échantillons pendant 7 minutes à 37 ° C.
3. Après l'incubation 7 minutes, ajouter 0,5 M EDTA à une concentration de 10 mM d'arrêter l'activité MNase.

3. Hypotonisation

1. Placer les échantillons dans un tube Falcon de 15 ml. Ajouter 10X le volume d'échantillon de 0,2 mm d'EDTA, 1 / 2000 du volume d'échantillon de benzamidine 0,2 M et le volume de l'échantillon 1 / 1000 de 0,1 M phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Les deux derniers composés sont utilisés comme inhibiteurs de protéase.
   * ÉTAPE CRITIQUE - Il est important de conserver les échantillons sur la glace durant toutes ces étapes.
2. Incuber l'échantillon pendant 1 heure, tandis qu'il vortex toutes les 10 minutes.
3. A la fin de l'incubation d'une heure de temps, ajouter du volume de l'échantillon 1 / 2000 de 3M TNT, encore un autre inhibiteur de protéase.
4. Échantillons Vortex fois de plus et centrifuger à 3175 RCF pendant 10 minutes à 4 ° C.
   * ÉTAPE FACULTATIVE - Precleansing avec la protéine G agarose.
   1. Prenez le surnageant et mettre en nouveaux tubes Falcon de 15 ml.
   2. Ajouter 500 ul de la protéine G agarose.
   3. Tournez à température ambiante pendant 30 min.
   4. Centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min à 4 ° C.
5. Distribuer le surnageant de telle sorte que 500 ul sont utilisés comme contrôle d'entrée (ne contenant que l'ADN génomique), et le reste est divisé en deux tubes contenant 1600 uL d'échantillon chacun - qui sont pour immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) échantillons.
6. Le contrôle d'entrée est placé à -80 ° CO / N jusqu'à utilisation ultérieure.
7. Pour les échantillons ChIP - ajouter du volume et de 1:10 de 10XFSB 4μg d'anticorps, puis de vortex les échantillons et les faire pivoter à 4 ° C pendant la nuit.
   ! ATTENTION - Montant et la dilution de l'anticorps peut exiger d'optimisation.

2 ^e jour

! ATTENTION! - Commencer 2 ^ème jour par le lavage de la protéine G agarose qui sera utilisée pour isoler l'ADN des nucléosomes. Depuis des billes d'agarose sont très sensibles, il est nécessaire de couper les têtes des conseils à chaque pipetage toute solution contenant des billes d'agarose.

1. Sonder la protéine G billes d'agarose de l'ADN

1. Ajouter 1,6 mL à 245 uL 1XFSB protéine G-agarose (pour 4 tubes) dans un microtube de 2 mL (boucle).
2. Séparer la solution en deux tubes de 2 mL et remplir chacune jusqu'à 1,6 mL avec 1X FSB.
3. Tournez à température ambiante pendant 30 secondes et centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec.
4. Eliminer le surnageant en utilisant un aspirateur.
5. Ajouter 1,6 mL 1X FSB à nouveau. Tournez les échantillons pendant 30 sec puis centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec.
6. Eliminer le surnageant à nouveau, et de combiner les deux tubes avec 1,5 mL 1XFSB.
7. Ajouter 15 uL d'ADN de sperme de saumon soniqué (10mg/ml).
   ! ATTENTION - Cette étape devrait, en principe, de réduire la liaison non spécifique de l'immunoprécipiter aux billes. Cependant, ce pourrait aussi conduire à de faux positifs pour certaines des séquences d'ADN (humain).
8. Tournez à température ambiante pendant 30 min, puis centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec.
9. Enlever le surnageant. Ajouter 200 ul de 1XFSB.
10. Ajouter 90 uL de billes d'agarose dans chaque échantillon ChIP. Tournez à 4 ° C pendant 1 heure.
11. Ajouter 1 ml de billes d'agarose 1XFSB en restant à servir de témoin négatif et tournent à 4 ° C pendant 1 heure.
12. Après l'incubation d'une heure de temps, centrifuger les échantillons et le contrôle négatif à 0,1 RCF pendant 30 sec. Jeter le surnageant.

2. Lavage des billes

! ATTENTION! - Tampons de lavage doivent être conservés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation, et doivent être utilisés que si sont moins d'un mois.

1. Ajouter 1 mL de chaque solution de lavage pour les perles et faire tourner pendant 3 min à température ambiante.
2. Centrifuger à 0,1 RCF pendant 30 sec.
3. Rejeter le surnageant à l'aide de vide.

* Chaque solution de lavage

- Mémoire tampon de lavage à basse sel

- Mémoire tampon de lavage haute du sel - Solution de chlorure de lithium - ne tournent à la température ambiante pendant 1 minute!

- Tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH = 8)

3. Élution

* ÉTAPE CRITIQUE - Faire Elution Buffer fraîche pour chaque expérience le jour où il doit être utilisé.

1. Ajouter 250 uL de tampon d'élution fraîchement préparés à chaque échantillon.
2. Tournez pendant 15 min à température ambiante, puis centrifuger à 0,4 RCF pendant 1 min.
3. Enregistrer le surnageant dans un tube à centrifuger 2,0 ml (Loop).
4. Ajouter 250 uL de tampon d'élution à chaque échantillon et de vortex à la main pendant quelques secondes. Ensuite, des échantillons de vortex pendant 15 minutes sur un mulitvortexer.
5. Centrifuger à 16 rpm FCR pendant 4 minutes et conserver le surnageant dans le tube même 2,0 mL (Loop).

4. Protéines Digest

1. Ajouter 10 ul EDTA 0,5 M, 25 ul de Tris-HCl 0,8 M, pH 6,5, 10 mg / ml de protéinase K (1 / 200 de l'échantillon) à chaque échantillon ChIP.
2. Pour chaque contrôle d'entrée, ajouter le tampon de lyse pour la protéinase K la digestion (1 / 10 de tampon d'échantillon) et 10mg/ml protéinase K (1 / 200 de tampon d'échantillon).
3. Incuber échantillons d'entrée et de ChIP 52 ° C pendant au moins 3 heures.

5. Phénol / chloroforme d'extraction

! ATTENTION - Expérience nécessitant phénol / chloroforme doit être effectuée sous le capot. Utilisez des gants en nitrile lors de la manipulation de phénol / chloroforme.

1. Après l'incubation de 3 heures, on ajoute les 500 pl de phénol-chloroforme à chaque échantillon.
2. Vortex tous les échantillons pendant plusieurs secondes, puis centrifuger à 13 rpm FCR pendant 5 min.
3. À ce stade, deux phases seront présents et nous sommes intéressés par le contenu de la phase supérieure. Sortez la phase supérieure et le mettre dans un microtube de 2 mL.
4. Ajouter un mélange de 2μL de glycogène et 50 pl d'acétate de sodium 3M à chaque échantillon avec 1,375 ml d'éthanol à 100%.
5. Vortex tous les échantillons vigoureusement. Placez-les dans -80 ° C la nuit.

3 ^ème jour

1. Retirer les échantillons sous forme de -80 ° C et les placer sur la glace pour les dégeler.
2. Centrifuger à 15 RCF pendant 10 minutes à 4 ° C.
3. Retirer délicatement le surnageant sans perturber le culot au fond du tube.
4. Ajouter 1 ml d'éthanol 75% froid pour chaque échantillon, puis inverser les 4-6 fois.
5. Centrifuger à 18 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
6. Retirer le surnageant fois de plus et permettent les granules d'air sec.
7. Dissoudre granulés séchés dans 50 ul de 4mm de Tris-HCl, pH8 et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Discussion

Le protocole décrit ici est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés dans les signatures de méthylation des histones et / ou de l'ADN du cerveau humain, parce que ces marques chromatine peuvent être moins enclins à des artéfacts post mortem par rapport à d'autres types de modifications, y compris (histones) acétylation et la phosphorylation ^{1, 2.} Le cerveau post-mortem se prêtent à l'étude de la mono-nucléosomes préparations; l'ADN reste largement attachée à la histones, au moins dans les échantillons à des intervalles autolyse représentant (le temps entre la mort et de congélation / stockage du tissu) typiquement dans la gamme des plusieurs heures jusqu'à 1,5 jours ^1. Toutefois, les mono-nucléosomes préparations pourraient être sensibles aux changements dans le positionnement des nucléosomes et des densités, en particulier autour des séquences entourant les sites de début de transcription de gènes ^3. Par conséquent, des expériences de contrôle avec modification indépendante des anticorps anti-histones devraient être inclus. Alternativement, il peut être possible d'isoler le poly-nucléosomes fractions d'extraits de cerveau humain, en utilisant les temps d'incubation plus courte pour les digérer micrococcal nucléase en conjonction avec des étapes de purification supplémentaires (y compris ultracentrifugation). Enfin, une étude récente sur l'échelle du génome facteur de transcription liant dans le cerveau post-mortem simplement cisaillés chromatine via sonication ^4. Notamment, la préparation de la chromatine par fixation préalable à la digestion sonication ou à base d'enzyme ne peut être idéal du point de vue des études post-mortem, car panne et / ou la reconfiguration des structures artificielles d'enseignement supérieur afin de chromatine après la mort sont confond potentiels difficiles à contrôler pour les. Ainsi, les tests post-mortem sur le cerveau ChIP sont susceptibles d'être utiles pour un nombre limité de molécules, y compris les histones et autres protéines nucléosomiques étroitement attachée à l'ADN génomique. Même avec cette mise en garde pris en compte, les approches décrites dans cette présentation sont susceptibles de fournir des informations nouvelles dans la chromatine associée à des mécanismes qui régissent les fonctions neuronales et gliales dans le cerveau normal et pathologique humain.

Nous avons utilisé cette technique avec succès principalement pour la mesure de la méthylation des histones et les occupations d'histone promoteurs spécifiques à l'aide de gène par gène qPCR ^{1, 5, 6.} Comme indiqué précédemment le cerveau post-mortem de l'homme semble se prêter à l'étude de la mono-nucléosomes préparations en raison de l'ADN reste largement attachée à la histones. Généralement, lors du démarrage avec 75 mg d'enfant humain ou d'un adulte cortex cérébral (substance grise), on peut s'attendre en utilisant le protocole présenté ci-dessus un rendement de 20-30 ng / ul dans un volume total de 50 pi pour l'entrée et 10-15 ng / ul dans un volume total de 50 pi pour CHIP, au moins lorsque la modification spécifique anti-histone anticorps sont utilisés. Le ChIP on appelle le ratio d'entrée est l'unité de mesure. La spécificité de la réaction est suivie par la fonte analyse de la courbe, l'électrophorèse sur gel, et le séquençage. En outre, les contrôles négatifs (i) n'ont pas les anticorps spécifiques ou (ii) contenant (non spécifique) des immunoglobulines doivent être traités par qPCR en parallèle à la puce et des échantillons d'entrée et ne devrait pas entraîner de produits spécifiques. Soyez conscient que lorsque le sperme de saumon est utilisé comme agent de blocage, des échantillons de contrôle peut entraîner un frottis lorsqu'il est exécuté sur un gel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.