Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Summary

Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell'istone e gli altri regolatori epigenetici dell'espressione genica nel cervello post-mortem.

Abstract

Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l'autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell'espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l'organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante - sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell'espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.

Protocol

Procedimento:

1 ^° Giorno

1. Omogeneizzare 50-500 mg di surgelati post-mortem del tessuto grigio questione con Douncing tampone.

! ATTENZIONE - tessuti umani devono essere maneggiati con cura in condizioni di sicurezza rigorose. Pertanto deve essere trattato a BSL-2 o superiore standard di sicurezza.

1. Prendere in precedenza sezionato, post-mortem del cervello da -80 ° C, li dounce del volume cerebrale di tampone 5X Douncing, e il luogo in tubo di 2,0 ml microcentrifuga. Abbinato campione e le coppie di controllo vengono elaborati contemporaneamente.

2. Micrococcal nucleasi (MN) digestione

1. Aggiungi 5U/mL di Micrococcal nucleasi al campione e mescolare all'interno della soluzione pipettando su e giù prima dell'immissione sul ghiaccio.
   * FASE CRITICA - E 'importante fare questo passo in fretta dato che MN ha la capacità di agire anche a 4 ° C.
2. Incubare i campioni per 7 minuti a 37 ° C.
3. Dopo l'incubazione 7 minuti, aggiungere 0.5M EDTA a una concentrazione di 10 mM per interrompere l'attività MNase.

3. Hypotonisation

1. I campioni in una provetta da 15 ml falco. Aggiungere 10 volte il volume del campione di 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 volume del campione di benzamidine 0,2 M e il volume del campione 1 / 1000 di phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). Gli ultimi due composti sono usati come inibitori della proteasi.
   * FASE CRITICA - E 'importante mantenere i campioni su ghiaccio per tutti questi passaggi.
2. Incubare campione per 1 ora, mentre vortex ogni 10 minuti.
3. Al termine della incubazione un'ora, aggiungere il volume del campione 1 / 2000 della 3M DTT, un altro inibitore della proteasi.
4. Campione vortice ancora una volta e centrifugare a 3175 RCF per 10 minuti a 4 ° C.
   * STEP OPTIONAL - Precleansing con proteine ​​G agarosio.
   1. Prendere surnatante e mettere in tubo di nuovo 15 ml falco.
   2. Aggiungere 500 ml di proteina G agarosio.
   3. Ruota a temperatura ambiente per 30 min.
   4. Centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
5. Distribuire in modo che surnatante 500 microlitri sono utilizzati come controllo di ingresso (che contiene solo DNA genomico), e il resto è diviso in due provette contenenti 1600 ml di ciascun campione - che sono per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) campioni.
6. Il controllo d'ingresso è posto a -80 ° CO / N fino a quando un ulteriore uso.
7. Per i campioni di ChIP - aggiungere volume 1:10 di 10XFSB e 4μg di anticorpi, poi vortice i campioni e farli ruotare a 4 ° C per una notte.
   ! ATTENZIONE - Importo e la diluizione di anticorpi può richiedere di ottimizzazione.

2 ^° Giorno

! ATTENZIONE! - Inizio 2 ^° giorno dal lavaggio delle proteine ​​G agarosio che verrà utilizzato per isolare il DNA nucleosomal. Dal perline agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare la testa delle punte quando pipettaggio qualsiasi soluzione contenente microsfere di agarosio.

1. Probing proteina G Beads agarosio al DNA

1. Aggiungere 1,6 mL 1XFSB a 245 microlitri proteina G-agarosio (sufficiente per 4 tubi) in una provetta 2 mL (anello).
2. Separare la soluzione in due 2 mL e ogni ricarica fino a 1,6 ml con 1X FSB.
3. Ruota a temperatura ambiente per 30 secondi e centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
4. Eliminare il surnatante con un aspirapolvere.
5. Aggiungere 1,6 ml 1X FSB ancora una volta. Ruotare i campioni per 30 secondi, quindi si centrifuga a 0,1 RCF per 30 sec.
6. Rimuovere il surnatante ancora una volta, e combinare entrambi i tubi con 1,5 ml 1XFSB.
7. Aggiungere 15 microlitri sonicato DNA dello sperma di salmone (10mg/ml).
   ! ATTENZIONE - Questo passo dovrebbe, in linea di principio, ridurre il legame non specifico del immunoprecipitato ai talloni. Tuttavia, questo potrebbe anche portare a falsi positivi per alcune delle (umano) sequenze di DNA.
8. Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti, poi centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
9. Rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 ml di 1XFSB.
10. Aggiungere 90 ml di perline agarosio in ogni campione ChIP. Ruota a 4 ° C per 1 ora.
11. Aggiungere 1 ml di 1XFSB nelle restanti perline agarosio per servire come controllo negativo e ruotare a 4 ° C per 1 ora.
12. Dopo le ore di incubazione lungo, centrifugare i campioni e di controllo negativo a 0,1 RCF per 30 sec. Scartare il surnatante.

2. Lavaggio delle Perle

! ATTENZIONE! - Buffer di lavaggio deve essere conservato a 4 ° C fino al momento dell'uso, e devono essere utilizzate solo se sono meno di un mese.

1. Aggiungere 1 ml di ogni soluzione di lavaggio ai talloni, ruotare per 3 minuti a temperatura ambiente.
2. Centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
3. Gettare il surnatante tramite aspirazione.

Ogni soluzione di lavaggio *

- Basso sale tampone di lavaggio

- Alta sale tampone di lavaggio - Soluzione di cloruro di litio - solo ruotare a temperatura ambiente per 1 minuto!

- Tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Eluizione

* FASE CRITICA - Fai Buffer fresca eluizione per ogni esperimento il giorno in cui deve essere utilizzato.

1. Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione appena preparati a ogni campione.
2. Ruotare per 15 minuti a RT, poi centrifugare a 0,4 RCF per 1 min.
3. Salvare il surnatante in una provetta da microcentrifuga 2,0 ml (Loop).
4. Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione per ogni campione e vortice a mano per pochi secondi. Poi, i campioni vortex per 15 minuti su un mulitvortexer.
5. Centrifugare a 16 RCF rpm per 4 minuti e salvare surnatante nello stesso tubo di 2,0 mL (Loop).

4. Digerire proteine

1. Aggiungere 10 microlitri EDTA 0.5M, 25 microlitri 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml di proteinasi K (1 / 200 del campione) per ogni campione ChIP.
2. Per ogni controllo in ingresso, aggiungere tampone di lisi per la digestione proteinasi K (1 / 10 di tampone campione) e 10mg/ml proteinasi K (1 / 200 di tampone del campione).
3. Incubare di ingresso e di campioni di chip a 52 ° C per almeno 3 ore.

5. Fenolo / cloroformio estrazione

! ATTENZIONE - Esperimento che richiedono fenolo / cloroformio deve essere effettuata sotto il cofano. Usare guanti di nitrile quando si maneggia fenolo / cloroformio.

1. Dopo l'incubazione 3 ore, si aggiunge il 500 microlitri fenolo-cloroformio per ogni campione.
2. Vortex tutti i campioni per alcuni secondi, poi centrifugare a 13 giri RCF per 5 min.
3. A questo punto, due fasi sarà presente e ci interessa il contenuto della fase superiore. Estrarre la fase superiore e metterla in una provetta 2 mL.
4. Aggiungere una miscela di 2μL di glicogeno e 50μL di acetato di sodio 3M per ogni campione con 1,375 ml di etanolo al 100%.
5. Vortex tutti i campioni vigorosamente. Metterli in -80 ° C durante la notte.

3 ^° giorno

1. Rimuovere campioni forma -80 ° C e metterli in ghiaccio per loro di disgelo.
2. Centrifugare a 15 RCF per 10 minuti a 4 ° C.
3. Rimuovere con cura sopranatante senza far muovere il sedimento sul fondo della provetta.
4. Aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 75% per ogni campione, poi capovolgere 4-6 volte.
5. Centrifugare a 18 RCF per 5 minuti a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante una volta di più e consentire il pellet di aria secca.
7. Sciogliere pellet essiccato in 50 ml di 4mm Tris-HCl, pH8 e conservare a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso.

Discussion

Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell'istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione ^{1, 2.} Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tempo tra la morte e il congelamento / conservazione del tessuto), tipicamente nella gamma di diverse ore fino a 1,5 giorni ^1. Tuttavia, mono-nucleosomal preparati potrebbero essere sensibili a variazioni nel posizionamento nucleosomal e densità, in particolare intorno sequenze circostanti siti trascrizione dei geni inizio ^3. Pertanto, esperimenti di controllo con modificazioni indipendente anti-istone anticorpi dovrebbero essere inclusi. In alternativa, può essere possibile isolare poli-nucleosomal frazioni di estratti di cervello umano, con tempi di incubazione più brevi per la nucleasi micrococcal digerire in concomitanza con le fasi di depurazione supplementare (incl. ultracentrifugazione). Infine, un recente studio sul genoma fattore di trascrizione vincolante nel cervello post-mortem semplicemente tranciate cromatina tramite sonicazione ^4. In particolare, la preparazione della cromatina di fissazione prima della digestione o sonicazione a base di enzimi può non essere ideale dal punto di vista degli studi post-mortem, perché guasto e / o riconfigurazione artificiale di strutture di ordine superiore della cromatina dopo la morte si confonde potenziali difficili da controllare per. Quindi, le analisi ChIP sul cervello post-mortem possono essere utili per un numero limitato di molecole, tra cui nucleo nucleosomal istoni e altre proteine ​​strettamente collegata al DNA genomico. Anche con questo avvertimento presi in considerazione, gli approcci descritti in questa presentazione sono suscettibili di fornire uno sguardo romanzo in cromatina associata a meccanismi che regolano le funzioni neuronali e gliali nel cervello normale e malati umani.

Abbiamo usato questa tecnica con successo soprattutto per la misurazione della metilazione dell'istone deacetilasi e occupazioni a specifici promotori utilizzando gene per gene qPCR ^{1, 5, 6.} Come affermato in precedenza il cervello post-mortem umano sembra essere riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparativi perché il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core. Di solito, quando si inizia con 75 mg di bambino umano o adulto corteccia cerebrale (sostanza grigia) ci si può aspettare usando il protocollo di cui sopra, un rendimento di 20-30 ng / mL in un volume totale di 50 microlitri per l'ingresso e 10-15 ng / mL in un volume totale di 50 microlitri per ChIP, almeno quando modifica specifica anti-istone anticorpi vengono utilizzati. Il chip in modo chiamati a rapporto di ingresso è l'unità di misura. Specificità della reazione viene monitorata l'analisi della curva di fusione, elettroforesi su gel, e la sequenza. Inoltre, controlli negativi (i) la mancanza di anticorpi specifici o (ii) contenente (non specifici) immunoglobuline dovrebbero essere trattati da qPCR in parallelo al chip ed i campioni di ingresso e non deve risultare in prodotti specifici. Essere consapevoli del fatto che quando lo sperma di salmone viene utilizzato come agente bloccante, campioni di controllo può provocare una macchia quando viene eseguito su un gel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.