والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Summary

حتى وقت قريب ، كانت مقتصرة على دراسات التعبير الكمي للدماغ الإنسان من الحمض النووي الريبي أو البروتينات. مع تقنيات مناعي لونين وصفها في هذه الورقة ، سوف يكون من الممكن مثلأيشن هيستون خريطة جينية والمنظمين الآخرين في التعبير الجيني في الدماغ بعد الوفاة.

Abstract

ويعتقد أن الأمراض العصبية المزمنة ، مثل انفصام الشخصية ومرض التوحد وثنائي القطب أن ينتج عن مزيج من العوامل الوراثية والبيئية التي قد تؤدي إلى تغيرات جينية في التعبير الجيني ، وعلم الأمراض الجزيئية الأخرى. تقليديا ، ومع ذلك ، اقتصرت الدراسات التعبير في الدماغ بعد الوفاة لتقدير حجم مرنا أو البروتين. القيود التي تصادف في أبحاث الدماغ بعد الوفاة مثل المتغيرات في وقت وانحلال ذاتي integrities الأنسجة ومن المرجح أيضا أن تؤثر أي دراسات العليا لونين هياكل النظام. ومع ذلك ، فإن منظمة nucleosomal من الحمض النووي DNA الجينومية بما في ذلك : هيستون الأساسية ملزمة -- على ما يبدو الى حد كبير في الحفاظ على عينات ممثلة المقدمة من البنوك المختلفة في المخ. ولذلك ، فمن الممكن لدراسة نمط مثلأيشن التساهمية والتعديلات الأخرى في histones الأساسية في مواضع محددة في الدماغ الجينومية بعد الوفاة. هنا ، نقدم مبسطة الأصلي مناعي لونين (NChIP) بروتوكول لعينات الدماغ المجمدة (ثابت أبدا) الإنسان. يمكن إكمال عملية الهضم بدءا من الخليط nuclease micrococcal الدماغ ، تليها NChIP qPCR في غضون ثلاثة أيام. وينبغي للمنهجية المعروضة هنا يكون من المفيد توضيح آليات التعبير اللاجينية الجينات في دماغ الإنسان العادي ومريضة.

Protocol

الإجراء :

1 ^ش اليوم

1. التجانس 50-500 ملغ من الأنسجة المجمدة المسألة بعد الوفاة رمادي مع Douncing العازلة.

! تنبيه --! يجب التعامل مع الأنسجة البشرية تحت رعاية شروط السلامة الصارمة. وينبغي التعامل معها في معايير السلامة BSL - 2 أو أعلى.

1. تشريح اتخاذ سابقا ، بعد الوفاة الدماغية من -80 درجة مئوية ، dounce لهم في حجم المخ 5X من الاحتياطي Douncing ، ووضعه في أنبوب 2.0 مل microcentrifuge. مطابقة العينة ويتم معالجتها التحكم أزواج في وقت واحد.

2. Micrococcal Nuclease (MN) الهضم

1. إضافة 5U/mL من nuclease Micrococcal إلى العينة وتخلط في حل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا قبل ان يضع على الجليد.
   * خطوة حاسمة -- ومن المهم القيام بهذه الخطوة بسرعة لأن MN لديه القدرة على الفعل عند 4 درجات مئوية حتى
2. احتضان العينات لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
3. بعد 7 دقائق حضانة ، إضافة إلى 0.5M EDTA بتركيز 10MM لوقف النشاط MNase.

3. Hypotonisation

1. عينات من مكان في أنبوب 15 مل الصقر. إضافة 10X حجم عينة من EDTA 0.2mM ، 1 / ​​2000 من حجم العينة وbenzamidine 0.2M 1 / 1000 من حجم العينة phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). وتستخدم هذه الأخيرة مجمعين باسم مثبطات البروتياز.
   * خطوة حاسمة -- من المهم للحفاظ على عينات على الجليد خلال كل هذه الخطوات.
2. احتضان عينة لمدة 1 ساعة ، في حين أنها vortexing كل 10 دقائق.
3. في نهاية حضانة طويلة ساعة ، إضافة 1 / 2000 من حجم العينة DTT 3M ، مثبط البروتياز أخرى.
4. نموذج الدوامة مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 3175 لمدة 10 دقائق في درجة مئوية 4
   * الخطوة اختيارية -- Precleansing مع بروتين G Agarose.
   1. طاف تأخذ وضعها في أنبوب جديد الصقر 15 مل.
   2. إضافة 500 ميكرولتر من البروتين G Agarose.
   3. تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   4. الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
5. توزيع طاف بحيث يتم استخدام 500 ميكرولتر وتحكم الإدخال (التي تحتوي على الحمض النووي الجيني فقط) ، وينقسم إلى قسمين بقية الأنابيب التي تحتوي على 1600 عينة من كل ميكرولتر -- التي هي لعينات لونين (CHIP) مناعي.
6. وضع عنصر التحكم في مدخلات -80 درجة ثاني / N حتى استخدامها مرة أخرى.
7. للعينات تشيب -- إضافة 1:10 من حجم 10XFSB و4μg من الأجسام المضادة ، ثم دوامة العينات وتناوب عليها عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
   ! تنبيه --! المبلغ قد والتخفيف من الأجسام المضادة تتطلب التحسين.

2 اليوم ^الثاني

! تحذير! -- تبدأ اليوم ^الثاني 2 بواسطة غسل بروتين G Agarose التي سيتم استخدامها لعزل الحمض النووي nucleosomal. منذ الخرز agarose حساسة للغاية ، فمن الضروري لقطع رؤوس من النصائح كلما pipetting أي محلول يحتوي على حبات agarose.

1. التحقيق بروتين G الخرز Agarose إلى الحمض النووي

1. إضافة 1.6 مل 1XFSB إلى 245 ميكرولتر agarose - G البروتين (ما يكفي لمدة 4 أنابيب) في أنبوب microcentrifuge 2 مل (حلقة).
2. حل فصل قسمين 2 مل أنابيب وإعادة ملء كل ما يصل إلى 1.6 مل مع FSB 1X.
3. تناوب على RT لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي عند 0.1 إطار التعاون الإقليمي لمدة 30 ثانية.
4. إزالة طاف به فراغ.
5. إضافة 1.6 مل 1X FSB مرة أخرى. تدوير عينات لمدة 30 ثانية ثم الطرد المركزي عند 0.1 إطار التعاون الإقليمي لمدة 30 ثانية.
6. إزالة طاف مرة أخرى ، والجمع بين كل من الأنابيب مع 1XFSB مل 1.5.
7. إضافة 15 ميكرولتر الحيوانات المنوية سالمون sonicated الحمض النووي (10mg/mL).
   ! تنبيه --! وينبغي لهذه الخطوة ، من حيث المبدأ ، وتخفيض غير محددة وملزمة للimmunoprecipitate إلى الخرز. ومع ذلك ، فإن هذا قد يؤدي ايضا الى ايجابيات كاذبة لبعض من تسلسل الحمض النووي (الإنسان).
8. تناوب على RT لمدة 30 دقيقة ، ثم الطرد المركزي عند 0.1 إطار التعاون الإقليمي لمدة 30 ثانية.
9. إزالة طاف. إضافة 200 ميكرولتر من 1XFSB.
10. إضافة 90 ميكرولتر من الخرز agarose في كل عينة الشذرة. تناوب على 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
11. إضافة إلى 1XFSB 1mL من الخرز agarose المتبقية لتكون بمثابة الشاهد السلبي وتدويره بنسبة 4 : 1 ساعة درجة مئوية.
12. بعد مرور فترة الحضانة الطويلة ساعة والطرد المركزي ومراقبة العينات السلبية عند 0.1 إطار التعاون الإقليمي لمدة 30 ثانية. تجاهل طاف.

2. غسل الخرز

! تحذير! -- يجب أن تحفظ في مخازن الغسل 4 درجات مئوية حتى استخدامها ، وسوف تستخدم فقط إذا كان أقل من شهر من العمر.

1. إضافة 1 مل من كل حل لغسل الخرز وتناوب لمدة 3 دقائق على RT.
2. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 0.1 لمدة 30 ثانية.
3. تجاهل الفراغ طاف به.

* في كل حل الغسيل

-- الغسيل قليلة الملح العازلة

-- غسل الأملاح عالية العازلة -- محلول كلوريد ليثيوم -- تدوير فقط في RT لمدة 1 دقيقة!

-- TE العازلة (10 ملي تريس ، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني = 8)

3. شطف

* خطوة حاسمة -- جعل الطازجة الاحتياطي لشطف كل تجربة في اليوم الذي يتم استخدامه.

1. إضافة 250 ميكرولتر من طازجة العازلة على استعداد لشطف كل عينة.
2. تدوير لمدة 15 دقيقة على RT ، ثم الطرد المركزي عند 0.4 RCF : 1 دقيقة.
3. حفظ طاف في microcentrifuge أنبوب 2.0 مل (حلقة).
4. إضافة 250 ميكرولتر من شطف العازلة لكل عينة ودوامة باليد لبضع ثوان. ثم ، وعينات دوامة لمدة 15 دقيقة على mulitvortexer.
5. الطرد المركزي في الدقيقة 16 RCF لمدة 4 دقائق ، وحفظ طاف في نفس الانبوب مل 2.0 (حلقة).

4. هضم البروتين

1. أضف 10 ميكرولتر EDTA 0.5M ، 0.8M 25 ميكرولتر تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 6.5 ، 10 ملغ / مل K بروتين (1 / 200 عينة) لكل عينة الشذرة.
2. إلى كل عنصر تحكم الإدخال ، إضافة العازلة للهضم تحلل بروتين K (1 / 10 من عينة عازلة) وبروتين 10mg/ml K (1 / 200 من العازلة العينة).
3. احتضان الإدخال والعينات في رقاقة 52 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعات.

5. الفينول / استخراج الكلوروفورم

! يجب أن يتم تنفيذ تجربة تتطلب الفينول / كلوروفورم تحت غطاء محرك السيارة -- تحذير! استخدام القفازات عند التعامل مع النتريل الفينول / الكلوروفورم.

1. بعد 3 ساعات الحضانة ، ونضيف إلى 500 ميكرولتر الفينول كلوروفورم ، إلى كل عينة.
2. دوامة جميع العينات لعدة ثوان ، ثم الطرد المركزي في الدقيقة 13 RCF لمدة 5 دقائق.
3. عند هذه النقطة ، سوف يكون على مرحلتين الحالية ونحن مهتمون في مضمون المرحلة الأعلى. إخراج المرحلة العليا ووضعها في أنبوب microcentrifuge 2 مل.
4. إضافة خليط من 2μL من الجليكوجين و50μL من خلات الصوديوم 3M لكل عينة مع 1.375 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪.
5. دوامة جميع العينات بقوة. وضعها في -80 درجة مئوية خلال الليل.

3 اليوم ^الثالث

1. إزالة عينات شكل -80 درجة مئوية ، ووضعها على الجليد بالنسبة لهم لذوبان الجليد.
2. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
3. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. إضافة 1 مل من الايثانول البارد 75 ٪ على كل عينة ، ثم قلب لهم 4-6 مرات.
5. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي لمدة 5 18 دقائق على 4 درجات مئوية.
6. إزالة طاف مرة أخرى والسماح للالكريات في الهواء الجاف.
7. حل الكريات المجففة في 50 ميكرولتر من 4mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، وتخزينها في pH8 -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

Discussion

الخطوط العريضة لبروتوكول هنا هو مفيدة بشكل خاص للمحققين مهتمة التواقيع مثلأيشن هيستون و / أو الحامض النووي من الدماغ البشري ، وذلك لأن هذه العلامات لونين قد تكون أقل عرضة للالتحف بعد الوفاة بالمقارنة مع أنواع أخرى من التعديلات ، بما في ذلك (هيستون) والفسفرة أستلة ^{1 2.} الدماغ بعد الوفاة غير قابلة للدراسة أحادية nucleosomal الاستعدادات ، والحمض النووي لا تزال تعلق إلى حد كبير إلى histones الأساسية ، على الأقل في عينات مع فترات انحلال ذاتي ممثل (الوقت بين الموت وتجميد / تخزين النسيج) عادة في نطاق عدة ساعات تصل إلى 1.5 أيام ^1. ومع ذلك ، يمكن أحادية nucleosomal الاستعدادات تكون حساسة للتغيرات في المواقع nucleosomal والكثافة ، وخاصة حول المواقع المحيطة تسلسل بدء النسخ من الجينات ^3. لذا ، ينبغي أن تدرج تجارب السيطرة مع أضداد هيستون التعديل مستقلة. بدلا من ذلك ، فإنه قد يكون من الممكن عزل بولي مقتطفات من الكسور nucleosomal الدماغ البشري ، وذلك باستخدام أقصر الأوقات حضانة للهضم nuclease micrococcal بالتزامن مع خطوات تنقية إضافية (بما في ذلك تنبيذ فائق). أخيرا ، دراسة حديثة حول الجينوم على نطاق عامل النسخ ملزمة في الدماغ بعد الوفاة المنفصمة ببساطة لونين عبر صوتنة ^4. على وجه الخصوص ، قد إعداد لونين من قبل التثبيت قبل صوتنة أو الانزيم المستندة الهضم لا يكون مثاليا من وجهة نظر الدراسات بعد الوفاة ، لأن انهيار و / أو إعادة تشكيل الهياكل الاصطناعية العالي لونين النظام بعد وفاة ويفند المحتملة من الصعب السيطرة عليها ل. وبالتالي ، المقايسات رقاقة على الدماغ بعد الوفاة يرجح أن تكون مفيدة لعدد محدود من الجزيئات ، بما في ذلك histones nucleosomal الأساسية والبروتينات الأخرى المرفقة بإحكام على الحمض النووي الجيني. حتى مع هذا التحذير في الاعتبار ، والنهج المبينة في هذا العرض من المحتمل أن تقدم أفكارا جديدة في لونين المرتبطة الآليات التي تحكم وظائف الخلايا العصبية في الدماغ الدبقية والإنسان العادي ومريضة.

وقد استخدمنا هذه التقنية بنجاح في المقام الأول لقياس مثلأيشن هيستون وإشغال هيستون في المروجين محددة باستخدام الجينات التي qPCR الجين ^{1 ، 5 ، 6.} كما ذكر سابقا في الدماغ بعد الوفاة البشرية ويبدو أن تكون قابلة للدراسة أحادية nucleosomal الاستعدادات لان الحمض النووي لا تزال تعلق إلى حد كبير إلى histones الأساسية. عادة ، عندما تبدأ مع 75 ملغ من الطفل البشري أو قشرة الدماغ الكبار (المادة الرمادية) ويمكن للمرء أن يتوقع باستخدام بروتوكول الواردة أعلاه ، وهو عائد من 20-30 نانوغرام / ميكرولتر في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر عن الإدخال و 10-15 نانوغرام / ميكرولتر في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر للرقاقة ، على الأقل عندما تستخدم تعديل هيستون محددة لمكافحة الأجسام المضادة. شريحة ما يسمى لنسبة الإدخال هو وحدة قياس. ويتم رصد نوعية رد الفعل من قبل ذوبان تحليل المنحنى ، هلام إستشراد ، وتسلسلها. بالإضافة إلى ذلك ، تسيطر السلبية (ط) التي تفتقر إلى أجسام مضادة محددة أو (ب) ينبغي المصنعة التي تحتوي على (غير محددة) من قبل qPCR المناعي بالتوازي مع رقاقة وعينات من المدخلات وينبغي ألا تسفر عن منتج معين. أن تكون على علم أنه عندما يتم استخدام الحيوانات المنوية السلمون كعامل عرقلة ، وعينات الرقابة قد يؤدي إلى تشويه عندما تعمل على هلام.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.