Summary
Das Aufkommen der ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie und des Cre / lox-System hat zu zahlreichen Fortschritte in der Molekularbiologie geführt, und hat sich als ein wertvolles Instrument für die Beurteilung der Funktion von Genen in transgenen Tieren. Dieses Interview beschreibt den Mechanismus der ortsspezifischen Rekombination durch Cyclisierung Rekombinase (Cre) und wie der Einsatz dieses Enzyms hat zur Entwicklung des bedingten Mutagenese, die erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen knock out-Strategien geführt hat.
Abstract
Ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie ermöglicht die Manipulation der Genstruktur die Genfunktion zu erkunden und hat sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug der Molekularbiologie. Site-spezifische Rekombinasen sind Proteine, die an bestimmte DNA-Zielsequenzen binden. Das Cre / lox-System wurde zum ersten Mal in Bakteriophagen in den 1980er Jahren beschrieben. Cre-Rekombinase ist ein Typ-I-Topoisomerase, die ortsspezifische Rekombination von DNA katalysiert zwischen zwei loxP (Ort der X-over P1) Seiten. Das Cre / lox-System benötigt keine Kofaktoren. LoxP-Sequenzen enthalten verschiedene Bindungsstellen für Cre-Rekombinase, die eine gerichtete Kernsequenz wo Rekombination und Umlagerung erfolgt umgeben. Wenn Zellen loxP-Seiten enthalten und drücken die Cre-Rekombinase, kommt es zu einer Rekombination Veranstaltung. Doppelsträngige DNA ist an beiden loxP-Stellen durch die Rekombinase Cre geschnitten, neu geordnet und ligiert ("Schere und Kleber"). Die Produkte der Rekombination Veranstaltung auf die relative Orientierung der asymmetrischen Sequenzen ab.
SSR-Technologie wird häufig als ein Werkzeug, um Genfunktionen erforschen. Hier das Gen von Interesse ist mit Cre Zielstellen loxP ("floxed") flankiert. Die Tiere werden dann mit den Tieren zum Ausdruck der Cre Rekombinase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors gekreuzt. In Geweben, die die Rekombinase Cre ausdrücken, bindet es an Zielsequenzen und schneidet das floxed Gen. Kontrollierte Gendeletion ermöglicht die Untersuchung von Genfunktionen in bestimmten Geweben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Analyse der Genfunktion beschäftigt SSR-Technologie --- bedingte Mutagenese - hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen knock-outs, wo Gendeletion ist häufig tödlich.
