Summary
이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.
Abstract
이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
분리 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 도금
일반적으로 합류 hESC 접시는 특정 hESC 라인에 따라 1시 10분에서 1시 6분까지을 분할 수 있습니다. 분할 플레이트는 분리 후 다시 5-7일 합류하게 될 것입니다.
- 분할 이틀 전에는 0.1 % 젤라틴 용액을 사용하여 번호판을 아교 질로 만들다. 6 - 잘 접시, 야간 37 ° C 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터의 각 잘하고 품어 플레이트에 2ml를 추가합니다.
- 플레이트 MEFs는 gelatinized 6 잘 접시에 하루는 분할에 hESCs를 계획하기 전에. (참고 : MEFs 3 일 전에 필요한 경우 많은처럼 도금 수 있습니다 ~ 3 일 후, MEFs은 아첨 확산 아웃 더 MEFs 수 hESCs뿐만 아니라 최신을 유지 수 없습니다된다..) G - 반구 또는 mitomycin의 약병을 가지고 C는 37 ° C의 물 목욕 2 분 액체 질소와 해동에서, 5-6 X 10 6 세포를 포함, CF1 MEFs 치료. 50ml 팰컨 튜브에 따뜻한 MEF 문화 미디어로 한 번 세포를 씻고 따뜻한 MEF 문화 미디어의 마지막 볼륨 resuspend. 5-6 X 10 6 세포에서이 정도면 충분 접시 두 개 또는 세 6 - 잘 접시입니다.
- MEFs 세차되고 있지만, gelatinized 접시를 꺼내 우물에서 모든 솔루션을 제거하고 잘 따라 MEF 문화 미디어 2.5 ML를 추가합니다.
- 각 우물에 최종 볼륨으로 3ml 달성하기 위해 잘 당 MEF 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. MEFs가 고르게 정착 하룻밤 인큐베이터에 다시 분산과 장소 플레이트 있는지 확인합니다.
- hESC 분리의 날, 1mg/ml의 <이주 된 무균 collagenase IV 솔루션을 새로운 준비하거나 사용합니다. 당신은 분할하려는 hESC의 우물에서 모든 미디어를 제거 2ml 당 잘 따뜻한 1 × PBS, pH를 7.4로 한번 씻어 및 collagenase IV 솔루션 1ml 추가할 수 있습니다. 37 ° C 50-10 분 알을 품다. 인큐베이터 밖으로 6 잘 hESC 판을 가지고 각 잘하는 ES 미디어 (bFGF없이)의 1ml를 추가합니다. 1ml 피펫으로 각 우물에 솔루션을 사용하면 미디어를 빨아하고 접시의 줄기 세포를 날려. 각 물론이 약 5-10 반복하게됩니다. 그런 다음, 50ml 팔콘 튜브에 정지 hESCs를 전송합니다. 분할되는 모든 우물에 대해이 작업을 수행 하나 50ml 팔콘 튜브에 결합. 펠렛은 5 분 200g에 실온에서 hESCs와 bFGF를 부족한 ES 매체와 한 번 씻으십시오.
- hESCs 세차되고 있지만, MEF의 접시를 꺼내 우물에서 모든 미디어를 제거하고 함께 한번 씻어 살균, 따뜻한 1 × PBS, 산도 7.4 다음 ES 미디어 2.5 ML (지금은 10 NG / ML bFGF와 보충) 당을 추가 음.
- 10ng/ml bFGF와 함께 보충 ES 미디어의 적절한 볼륨에 pelleted hESCs을 Resuspend. (참고 :.. hESCs가 resuspended 때, 그들은 대략 균일한 콜로니 크기와 모양이어야합니다 resuspension 볼륨 분할 비율에 따라 달라집니다) 조심스럽게 피펫은 hESC 중지 위아래로 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해, 하지만 정말 하나의 셀 또는 아주 작은 식민지가 생성됩니다. 각 우물에 최종 볼륨으로 3 ML을 달성하기 위해 MEF 플레이트에 잘 당 hESC 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. 시각 hESCs가 밤새 해결하기 위해 인큐베이터에 다시 접시를 삽입하기 전에 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 도금 후, 일반적으로 그들의 특성 모양과 테두리 모양을 맡을 식민지에 대한 몇 일 소요됩니다.
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Discussion
이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 도금 전에 마지막 단계에서 hESCs가 resuspended 때, 그들은 약 균일 콜로니 크기와 모양을해야합니다. 조심스럽게 hESC의 정지를 피펫 아래 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해,하지만 너무 많은 단일 셀 또는 아주 작은 식민지 같은 월 hESC pluripotency 마커에 대한 generated.Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry있다 4 SSEA - 4, 문화 중에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.
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Acknowledgments
Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
